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Rev Esp Patol 2017;50:113-23 - DOI: 10.1016/j.patol.2016.11.002
REVISIÓN
Planos conjugados y sistema de iluminación de Köhler en microscopía óptica
Conjugate planes and Köhler illumination in optical microscopy
Antonio García-Escuderoa,, , Gloria Navarro-Bustosb, Sebastián Umbría-Jiméneza, Ricardo González-Cámporaa, Hugo Galera-Davidsonb
a Servicio de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen Macarena, Sevilla, España
b Centro de Anatomía Patológica y Citopatología, Sevilla, España
Recibido 28 septiembre 2016, Aceptado 18 noviembre 2016
Resumen

Un adecuado conocimiento y comprensión del concepto de planos conjugados es de capital importancia en la utilización del microscopio por cuanto que desde hace ya bastante tiempo el diseño de los microscopios se basa en la correcta situación de sus dos conjuntos de planos conjugados. En 1893 August Köhler publicó el trabajo «Un nuevo sistema de iluminación en microfotografía» donde dio a conocer los fundamentos básicos de una técnica de iluminación que actualmente lleva su nombre. El conocimiento y aplicación de los principios del sistema de iluminación de Köhler constituye el elemento de mayor importancia en el correcto manejo de un microscopio. Dichos principios no siempre son bien conocidos y comprendidos por los usuarios del microscopio constituyendo una fuente frecuente de errores en microscopía, particularmente en microfotografía. En este artículo revisamos los principios básicos del concepto de planos conjugados y del sistema de iluminación de Köhler.

Abstract

Adequate knowledge and understanding of the concept of conjugate planes is of paramount importance in the use of the microscope and for a long time microscope design was based on the correct location of the two sets of conjugate planes. In 1893 August Köhler published the article «A new illumination system in microphotography» in which he introduced the basics of an illumination technique that now bears his name. The knowledge and application of the principles of the Köhler illumination system is the most important element in the proper handling of a microscope. These principles are not always well known or understood by the users of microscopes, frequently leading to errors in microscopy, particularly in photomicrography. This article reviews the basic principles of the concept of conjugate planes and Köhler illumination system.

Palabras clave
Microscopía óptica, Planos conjugados, Iluminación de Köhler
Keywords
Optical microscopy, Conjugate planes, Köhler illumination
Introducción

Un adecuado conocimiento y comprensión del concepto de planos conjugados es de capital importancia en el manejo y utilización del microscopio por cuanto que desde hace ya bastante tiempo el diseño de los microscopios se basa en la correcta situación de sus dos conjuntos de planos conjugados. El usuario del microscopio debe conocer la ubicación física exacta de dichos conjuntos de planos conjugados y deben ser accesibles dado que a través de ellos se pueden modificar parámetros básicos de la calidad de la imagen. Una inadecuada configuración de los parámetros derivados del concepto de planos conjugados se halla en el origen de muchas imágenes defectuosas generadas por el microscopio, especialmente en el campo de la microfotografía y constituye una fuente muy frecuente de errores en microscopía.

En 1893 August Köhler (1866-1948) (fig. 1) publicó el trabajo1 «Un nuevo sistema de iluminación en microfotografía» donde dio a conocer los fundamentos básicos de una técnica de iluminación que actualmente lleva su nombre. Dicha técnica revolucionó el diseño de los microscopios y sus principios siguen gobernando la construcción de los actuales microscopios. El sistema de iluminación de Köhler resulta de aplicación no solo en microscopía óptica convencional (de luz transmitida y reflejada) sino también en otras técnicas de microscopía como contraste de fases, microscopía de contraste por interferencia diferencial, epifluorescencia y microscopía confocal. El conocimiento y aplicación de los principios del sistema de iluminación de Köhler constituye el elemento de mayor importancia en el correcto y adecuado uso y manejo de un microscopio, con objeto de extraer al máximo las potencialidades del microscopio como sistema formador de imágenes de alta calidad. Todo usuario de un microscopio debería dominar dichos fundamentos y conocer en profundidad la herramienta de trabajo que supone un microscopio, antes de avanzar (y para poder avanzar) en el aprendizaje de la interpretación de las imágenes que proporciona.

Figura 1.

August Köhler.

Han transcurrido más de cien años desde la publicación de Köhler y el adecuado uso y manejo del microscopio es algo que se da por sabido pero que con mucha frecuencia nadie explica y que no viene recogido en los principales textos de nuestra disciplina. Cuando un residente llega por primera vez a los servicios de anatomía patológica se le entrega un microscopio, generalmente no de última generación, y que ha pasado por muchas manos por lo que su estado no siempre es el idóneo. Se enfrentan entonces (nos hemos enfrentado) a un curioso artefacto lleno de mandos y palanquitas de dudosa utilidad excepto para deteriorar la imagen y modificar su brillo. En el mejor de los casos, algún atareado adjunto, en un acto caritativo, se aviene a centrar la óptica y nos dice que ya se encuentra en «perfecto» estado pero que no toquemos esto ni lo otro. Este artículo puede ser de utilidad para aquellos residentes que se enfrentan por primera vez a este artilugio que les acompañará durante toda su vida (salvo que las nuevas tecnologías terminen por arrinconarlo, cosa que nos parece poco probable) y para todos aquellos que hemos aprendido de forma «empírica» el manejo del microscopio.

Planos conjugados

El término conjugado es un adjetivo aplicable a líneas o cantidades que están enlazadas por una ley o relación determinada. En óptica geométrica dicha ley o relación sería la acción (refracción o reflexión) del sistema óptico, de tal manera que a un objeto le corresponde una imagen siendo objeto e imagen elementos conjugados. En la práctica se habla de planos conjugados para referirse a un conjunto de planos en un sistema óptico formador de imágenes que están ligados ópticamente y cuyas imágenes están superpuestas al observador y se hallan simultáneamente en foco2. Cuando existen diferentes conjuntos de planos conjugados los elementos situados en uno de estos conjuntos no serán visibles en el resto de los conjuntos de planos conjugados.

En el microscopio existen dos conjuntos principales de planos focales conjugados: el conjunto de planos de apertura (también llamado de iluminación) y el conjunto de planos de campo (o de formación de imagen).

Los planos que integran el conjunto de planos conjugados de apertura son2,3:

  • -

    Filamento de la bombilla.

  • -

    Diafragma de apertura (DA) del condensador (apertura del condensador, habitualmente situado en el plano focal anterior u objeto del condensador).

  • -

    Apertura posterior del objetivo, habitualmente situada en o muy cerca del plano focal posterior o imagen del objetivo (dependiendo de la longitud focal del mismo).

  • -

    Pupila de salida del microscopio, también llamada disco de Ramsden o punto del ojo, coincidente con el iris del globo ocular.

Los elementos correspondientes al conjunto de planos conjugados de campo son2,3:

  • -

    Diafragma iris de campo (DC) o diafragma Köhler, generalmente situado la base del microscopio.

  • -

    Preparación histológica enfocada (plano objeto).

  • -

    Plano de imagen intermedia situado en el diafragma fijo del ocular.

  • -

    Retina del ojo o detector (de cámara digital de fotografía o video o emulsión fotográfica).

Sistemas de iluminación

El concepto de planos conjugados se encuentra íntimamente relacionado con los diferentes sistemas de iluminación que se pueden emplear en microscopía. Con excepción de la microscopía de fluorescencia, las muestras necesitan ser iluminadas para que puedan ser visualizadas en el microscopio dado que no emiten luz propia. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes sistemas de iluminación. La primera fuente de luz utilizada en microscopía fue la propia luz natural procedente del cielo que era recogida por un espejo y dirigida hacia la vía óptica del microscopio. Las nubes actuaban, ocasionalmente, como un filtro difusor. Dicho sistema de iluminación se denomina afocal por cuanto que no se genera una imagen enfocada de la fuente de luz en ningún punto de la vía óptica. Este sistema presenta algunos inconvenientes evidentes como la imposibilidad de modular la intensidad de la luz o la necesidad de realizar la observación en el exterior o cerca de una ventana. Para obviar este problema se introdujeron fuentes de luz artificial. No obstante, seguían siendo sistemas afocales que no producían una imagen de la fuente de luz en ningún punto.

En el siglo XIX el microscopista británico Edward Nelson desarrolló un sistema de iluminación que fue utilizado ampliamente durante la última parte del siglo XIX y buena parte del siglo XX y que incluso hoy en día sigue siendo utilizado, de forma muy minoritaria. Este sistema de iluminación, denominada crítica o nelsoniana, se basa en la colocación de una lente condensadora enfocable previa a la preparación histológica, que genera una imagen enfocada de la fuente de luz en el plano de la preparación histológica. Sería como si el objeto se convirtiera en un elemento autoluminiscente. La principal ventaja de este sistema de iluminación es que proporciona una alta eficiencia4. El inconveniente es que son precisas fuentes de luz muy homogéneas para evitar variabilidad en la iluminación a lo largo del objeto y que la imagen de la fuente pueda superponerse a la propia imagen del objeto2. Según este diseño el conjunto de planos conjugados de formación de imágenes incluye al filamento de la bombilla, a la preparación histológica, al diafragma fijo del ocular y a la retina.

Sistema de iluminación de Köhler

Köhler observó durante la realización de su tesis doctoral sobre la taxonomía de las lapas en el Instituto Zoológico de la Universidad de Giessen (Alemania) que su trabajo de investigación dependía en gran medida de la obtención de imágenes microscópicas de suficiente resolución y calidad. El sistema de iluminación crítica que se utilizaba por aquel entonces proporcionaba una iluminación irregular y desigual de la preparación histológica. Por ello se vio obligado a concebir un nuevo sistema que proporcionase una iluminación homogénea y uniforme de toda la preparación, incluso, a partir de fuentes de luz intrínsecamente heterogéneas como las lámparas incandescentes.

En el sistema de iluminación de Köhler el microscopio está diseñado de tal modo que coexisten recíprocamente los dos conjuntos de planos focales conjugados, de apertura y de campo, a los que aludimos anteriormente.

En la vía de iluminación (fig. 2) observamos que los rayos luminosos procedentes de un mismo punto de la fuente de iluminación (filamento de la bombilla) por acción de la lente colectora se intersectan en el plano focal objeto del condensador, donde se sitúa su DA, y por tanto forman una imagen del filamento en esta localización. Dicha imagen del filamento y el propio DA actúan como objetos para la siguiente lente, el condensador. Al situarse sobre el plano focal objeto de dicha lente, los rayos luminosos procedentes de ellos (imagen del filamento y DA) tras atravesar el condensador son refractados con trayectorias paralelas entre sí, actuando el condensador como una lente colimadora. Dichos haces de rayos paralelos alcanzan la preparación histológica proporcionando a la misma una iluminación homogénea y uniforme. Al disponerse las trayectorias de los rayos de forma paralela en el plano del objeto (preparación histológica) no se forma una imagen de la fuente de luz en dicho plano, a diferencia de lo que ocurría en el sistema de iluminación crítica. Estos rayos de luz paralelos, tras atravesar la preparación histológica, continúan en trayectorias paralelas incidiendo en la lente objetivo y son refractados por esta confluyendo en el punto focal imagen de la misma a cuyo nivel se sitúa la apertura posterior del objetivo. Por tanto, en esta apertura posterior del objetivo, se forma la imagen de la imagen del filamento y la imagen del DA del condensador. Estos tres elementos (la imagen de la imagen del filamento, la imagen del DA y la apertura posterior del objetivo) actúan como objetos para la siguiente lente que es la lente del tubo (en sistemas de objetivos corregidos al infinito). Los rayos procedentes de estos elementos tras atravesar la lente del tubo siguen trayectorias paralelas (no forman ninguna imagen) incidiendo en el ocular que finalmente los hace converger en su punto focal imagen. En dicho punto focal se sitúa la pupila de salida del microscopio o disco de Ramsden a cuyo nivel el observador, de forma instintiva, debe colocar su globo ocular (en concreto el iris). Este disco es visible como un punto o disco luminoso situado generalmente en torno a un centímetro por encima (por fuera) de la lente superior del ocular. En este punto (pupila de salida o disco de Ramsden) se va a formar la imagen de la imagen de la imagen del filamento, la imagen de la imagen del DA y la imagen de la apertura posterior del objetivo. Todos estos planos de la vía de apertura (filamento de la bombilla, DA del condensador, apertura posterior del objetivo y disco de Ramsden) son planos conjugados entre sí y todos los elementos situados en ellos son visibles simultáneamente y en foco.

Figura 2.

Representación gráfica de la vía óptica de apertura a partir de un punto extraaxial (arriba) y axial (abajo) del filamento de la bombilla. En azul, las lentes, en rojo, los planos conjugados de apertura y en verde los planos conjugados de campo. Fcon: punto focal objeto del condensador; Fob: punto focal objeto del objetivo; F’oc: punto focal imagen del ocular.

La figura 3 representa gráficamente la vía de campo. Los rayos procedentes de un mismo punto del DC son refractados por el condensador y concentrados en el plano objeto (preparación histológica) formándose la imagen del DC en este plano. A su vez estos dos elementos, imagen del DC y la propia preparación histológica, actúan como objetos para la siguiente lente que es el objetivo. En los sistemas corregidos al infinito la preparación histológica (y la imagen del DC) se sitúan en el plano focal objeto del objetivo (en eso consiste precisamente el enfoque de la preparación, en colocarla en el punto focal objeto del objetivo) por lo que este actúa como una lente colimadora y los rayos refractados siguen trayectorias paralelas entre sí no formando ninguna imagen. Esto rayos paralelos se transmiten por el espacio afocal infinito, situado entre la apertura posterior del objetivo y la lente del tubo, incidiendo sobre la lente del tubo que los hace converger en su plano focal imagen a cuyo nivel se sitúa el diafragma fijo del ocular. A este nivel se forma, por tanto, la imagen de la imagen del DC y la imagen de la preparación histológica (o imagen intermedia que posteriormente será aumentada por el ocular para obtener la imagen final). El diámetro de este diafragma fijo del ocular, cuyo valor (FN, field number) viene recogido enmm en la superficie externa del ocular determina el tamaño del campo de visión4. De manera sencilla se puede calcular el diámetro del campo visual para cada objetivo dividiendo dicho número de campo entre los aumentos del objetivo que estemos utilizando2. Por ejemplo, el diámetro de dicho campo para un objetivo de 10x con un ocular con un campo de 20 será de 2mm. En la tabla se recogen las dimensiones del campo de visión para las combinaciones más habituales de oculares y objetivos. (tabla 1).

Figura 3.

Representación gráfica de la vía óptica de campo a partir de un punto extraaxial (arriba) y axial (abajo) del diafragma de campo. En azul, las lentes, en rojo, los planos conjugados de apertura y en verde los planos conjugados de campo. Fcon: punto focal objeto del condensador; Fob: punto focal objeto del objetivo; F’oc: punto focal imagen del ocular.

Tabla 1.

Dimensiones del campo de visión para las combinaciones más habituales de oculares y objetivos

Aumentos objetivoOcular con FN 18Ocular con FN 20Ocular con FN 22Ocular con FN 25
Diámetro del campo (mm)  Área del campo (mm21 mm2= campos  Diámetro del campo (mm)  Área del campo (mm21 mm2= campos  Diámetro del campo (mm)  Área del campo (mm21 mm2= campos  Diámetro del campo (mm)  Área del campo (mm21 mm2= campos 
18  254,47  0,004  20  314,16  0,003  22  380,13  0,003  25  490,88  0,002 
1,25  14,40  162,86  0,01  16  201,06  0,005  17,60  243,29  0,004  20  314,16  0,003 
63,62  0,02  10  78,54  0,01  11  95,03  0,01  12,50  122,72  0,01 
2,5  7,20  40,72  0,02  50,27  0,02  8,80  60,82  0,02  10  78,54  0,01 
4,50  15,90  0,06  19,64  0,05  5,50  23,76  0,04  6,25  30,68  0,03 
3,60  10,18  0,10  12,57  0,08  4,40  15,21  0,07  19,64  0,05 
10  1,80  2,54  0,39  3,14  0,32  2,20  3,80  0,26  2,50  4,91  0,20 
20  0,90  0,64  1,57  0,79  1,27  1,10  0,95  1,05  1,25  1,23  0,81 
40  0,45  0,16  6,29  0,50  0,20  5,09  0,55  0,24  4,21  0,63  0,31  3,26 
60  0,30  0,07  14,15  0,33  0,09  11,46  0,37  0,11  9,47  0,42  0,14  7,33 
63  0,29  0,06  15,60  0,32  0,08  12,63  0,35  0,10  10,44  0,40  0,12  8,09 
100  0,18  0,03  39,30  0,20  0,03  31,83  0,22  0,04  26,31  0,25  0,05  20,37 

Finalmente la acción combinada del ocular del microscopio y del aparato refractivo del ojo generan en la retina una imagen enfocada de la imagen de la imagen del DC, de la imagen intermedia y del diafragma fijo del ocular. Todos estos planos de la vía de campo (DC, preparación histológica, diafragma fijo del ocular y retina) son, por tanto, planos conjugados entre sí.

Estos planos conjugados de campo, serán visibles mirando a través del ocular del microscopio, modo de visión denominada visión ortoscópica (o normal)3. La imagen así obtenida, llamada imagen ortoscópica, incluirá al diafragma de campo, a la preparación histológica y al diafragma fijo del ocular así como a los posibles accesorios colocados en dichos planos. Para acceder a las imágenes correspondientes al conjunto de planos de apertura es necesario retirar el ocular del microscopio y mirar a través del tubo de inserción del mismo. Este modo de visión se denomina conoscópica (o de difracción o de apertura) y la imagen así obtenida imagen conoscópica. Dicha imagen es muy pequeña por lo que para poder visualizarla con mayor precisión puede ser necesaria la inserción de un ocular telescópico o de una lente de Bertrand4,5. Los elementos situados en un conjunto de planos conjugados no serán visibles en el otro conjunto. Es decir en el modo de visión ortoscópica no se visualizan los elementos pertenecientes a la vía de apertura y de manera recíproca en visión conoscópica no se puede acceder a la imagen de los elementos del conjunto de planos conjugados de campo3.

La existencia de dos conjuntos de planos focales conjugados independientes es lo que define al sistema de iluminación de Köhler. Las trayectorias de los rayos luminosos de una de las dos vías (de apertura y de campo) generalmente siguen trayectorias paralelas o divergentes cuando atraviesan los planos conjugados de la otra vía.

Otras aplicaciones del concepto de planos conjugados

La adecuada comprensión del concepto de planos conjugados es de utilidad no solo para conseguir un sistema que proporcione una iluminación homogénea, difusa y uniforme de la preparación histológica (iluminación de Köhler). Adicionalmente, proporciona conocimientos valiosos para la adecuada colocación de accesorios6 y para localizar el origen de artefactos de imagen. Algunos de esos accesorios como retículas, escalas graduadas o señaladores ópticos están diseñados específicamente para proporcionar una imagen sobreimpuesta a la preparación histológica. Para ello, estos accesorios deben ser colocados en alguno de los planos que integran el conjunto de planos conjugados de campo, habitualmente el diafragma fijo del ocular, de tal modo que la imagen de estos elementos se superpone de forma nítida y a foco sobre la imagen de la preparación histológica. Esta imagen de los accesorios no se mueve al desplazar la preparación al no situarse directamente sobre la misma. Por el contrario, otros accesorios (como los prismas de Wollaston o las placas de fase) tienen por objeto modificar la vía de iluminación sin que su imagen aparezca sobre la de la preparación histológica. Por tanto, deben ser colocados en alguno de los planos de la vía de iluminación o de apertura como puede ser el plano focal objeto del condensador (donde se sitúa el DA) o la apertura posterior del objetivo. Finalmente, los polarizadores y analizadores se suelen situar alejados tanto de los planos conjugados de apertura como de los planos conjugados de campo con objeto de no deteriorar las condiciones de iluminación ni introducir artefactos en la imagen derivados de la posible existencia de suciedad o huellas digitales.

El conocimiento de la localización de los planos puede contribuir a determinar el origen de posibles defectos de imagen derivados de daños en los elementos ópticos o de la acumulación de polvo y suciedad6. Cuando el defecto aparece de forma nítida y a foco con la imagen, probablemente su origen se sitúe en alguno de los elementos que integran el conjunto de planos conjugados de campo. Entre ellos destacan la propia preparación histológica (en cuyo caso el defecto se moverá solidariamente con ella), la lente frontal del objetivo, la lente abatible del condensador, la lente inferior del ocular o los elementos situados en vecindad del DC. Si las imperfecciones o contaminantes aparecen borrosos y fuera de foco con la preparación su procedencia serán los elementos próximos al conjunto de planos de apertura como el condensador, la lente superior del ocular o la lente frontal del objetivo. Si la imperfección resulta visible solo a través de uno de los dos oculares, este será su origen. Cuando el defecto se mueve al rotar el ocular, el objetivo o el condensador, en dichos elementos debe buscarse la procedencia del artefacto.

Ajustes en el microscopio para optimizar el sistema de iluminación de Köhler

  • 1.

    Ajustes preliminares.

    • a.

      Encender el microscopio.

    • b.

      Abrir completamente los diafragmas de apertura y de campo.

    • c.

      Colocar una preparación histológica en la platina y situar el condensador (su lente superior) 2mm por debajo de la preparación.

    • d.

      Insertar el objetivo de 10x en la vía óptica.

    • e.

      Ajustar el voltaje de la lámpara para obtener una intensidad de luz confortable.

  • 2.

    Ajuste del cabezal del microscopio.

    • a.

      Ajuste de la distancia interpupilar hasta obtener un campo visual único.

    • b.

      Ajuste dióptrico. En la mayoría de los oculares existe un anillo de corrección dióptrica que permite corregir posibles diferencias de refacción entre ambos ojos así como asegurar la parafocalidad (característica que permite que una preparación histológica permanezca enfocada al cambiar de objetivo).

      • i.

        Para realizar el ajuste dióptrico se deben colocar «a cero» los anillos dióptricos de cada ocular. A continuación con el objetivo de 10x, se procede a enfocar la preparación utilizando los mandos macro- y micrométrico. Acto seguido se inserta el objetivo de 4 o 5x y se vuelve a enfocar la preparación utilizando los anillos dióptricos de cada ocular. Se inserta el objetivo de 20x y se reenfoca la preparación mediante los ajustes macro/micrométricos. Finalmente se vuelve nuevamente al objetivo de 4 o 5x y se reenfoca con los anillos dióptricos. Muchos oculares junto con el anillo dióptrico incluyen una escala graduada. Anotando dichas medidas se puede restablecer rápidamente el ajuste dióptrico óptimo para cada usuario.

      • ii.

        Si solo se dispone de un ocular con anillo dióptrico, colocar en el tubo derecho el ocular sin anillo dióptrico y mirando solo a través de este ocular enfocar la preparación con los mandos macro/micrométrico. A continuación mirando solo por el ocular izquierdo se reenfoca la preparación mediante el anillo dióptrico. Este último procedimiento permite compensar diferencias refractivas entre ambos ojos pero no asegura la parafocalidad.

      • iii.

        Para establecer la parafocalidad entre una cámara y el microscopio se debe enfocar la imagen en la pantalla con el mando macro/micrométrico y reajustar el enfoque en el microscopio con el anillo dióptrico de los oculares.

  • 3.

    Ajuste de la posición (altura y centrado) del condensador.

    El procedimiento de ajuste del microscopio para el sistema de iluminación de Köhler, propiamente dicho, comienza a partir de este punto. Una vez enfocada la preparación histológica con el objetivo de 10x se debe cerrar el diafragma iris de campo hasta que la imagen de sus hojas se haga visible sobre la imagen de la preparación histológica. Accionando el tornillo estriado que regula la altura del condensador se debe enfocar dicha imagen del DC hasta que se obtenga una imagen lo más nítida posible del mismo. Con condensadores de bajo coste, tipo Abbe, es difícil obtener una imagen muy nítida del DC, debido a la aparición de halos de color variable (del azul al rojo). Ello es debido a una falta de corrección de las aberraciones cromáticas en el condensador. En este tipo de condensadores, para ajustar su altura, puede servir de referencia como punto de máxima nitidez el cambio de color del azul al rojo (o viceversa). Estos condensadores tipo Abbe son apropiados para microscopios de rutina equipados con objetivos con bajo nivel de corrección de aberraciones cromáticas (objetivos acromáticos). Para microfotografía se aconsejan condensadores aplanáticos y acromáticos6, de mayor coste y calidad óptica, con los que se pueden conseguir imágenes muy nítidas del DC.

    Una vez enfocada la imagen de este diafragma se procederá al centrado de dicha imagen (y por tanto también del condensador) accionando los tornillos específicos de centrado del condensador. Esta maniobra resulta más sencilla abriendo el DC cerca del límite del campo visual. Una vez centrado el condensador se comprobará nuevamente el correcto enfoque de la imagen del DC y se abrirá dicho diafragma hasta el límite (inmediatamente por fuera) del campo de visión del objetivo que estemos utilizando (o de la cuadrícula del área de captura en microfotografía)5. Con ello conseguimos iluminar exclusivamente aquella parte de la preparación incluida en el campo de visión del objetivo bloqueando y evitando que la luz parásita reflejada/refractada por la preparación u otros elementos del sistema óptico puedan deteriorar la imagen (aparición de brillo indeseado y pérdida de contraste)6.

  • 4.

    Centrado y enfoque de la fuente de luz

    La mayoría de los microscopios que se fabrican actualmente están diseñados para trabajar según las condiciones de iluminación de Köhler proporcionando una imagen del filamento de la bombilla en la apertura del diafragma del condensador (DA). Esta imagen debe hallarse centrada y enfocada en dicha apertura ocupando la mayor parte de la misma. Se puede acceder visualmente a la imagen del filamento cerrando el DA del condensador (o colocando un papel blanco a dicho nivel) o bien mediante visión conoscópica en la apertura posterior del objetivo, que como vimos anteriormente es un plano conjugado con el DA del condensador y con el filamento de la bombilla. Muchos microscopios incluyen un filtro difusor esmerilado situado en proximidad a la fuente de luz como elemento coadyuvante para conseguir una iluminación homogénea2. Dicho filtro debe ser retirado para poder visualizar la imagen del filamento de la bombilla. Si la imagen del filamento aparece descentrada deberá procederse a su centrado accionando los dos tornillos específicos (x, y) generalmente situados en la carcasa del sistema de iluminación. A continuación debe procederse a enfocar la imagen del filamento en el plano del DA (y por tanto también en el plano de la apertura posterior del objetivo) accionando el correspondiente tornillo de la carcasa (Z) que modifica la posición de la lente colectora. Algunos modelos de microscopio utilizan un sistema de proyección externa para el centrado y enfoque del filamento de la bombilla. En todo caso deberemos atenernos, en este sentido, a las instrucciones suministradas por el fabricante del microscopio. Este ajuste solo necesita ser realizado o verificado muy ocasionalmente (al cambiar la bombilla por ejemplo).

    Actualmente muchos modelos de microscopio vienen equipados con una fuente de iluminación precentrada y preenfocada no siendo necesario (ni aconsejable) realizar este ajuste.

    Al enfocar las imágenes del filamento de la lámpara y del DC estamos situando en sus ubicaciones físicas precisas los dos conjuntos de planos conjugados (de iluminación y de formación de imagen)3,5 anteriormente aludidos, posibilitando una imagen de máxima calidad mediante una iluminación óptima y uniforme, que caracterizan al sistema de iluminación de Köhler.

  • 5.

    Ajuste del diafragma de apertura del condensador

    Mediante el DA del condensador se modifican parámetros básicos en la calidad de la imagen tales como la resolución, el contraste, el brillo y la profundidad de campo5. La resolución de un instrumento óptico es la capacidad de dicho instrumento para representar separadamente en la imagen dos puntos situados muy próximos entre sí en el plano objeto2,4. Refleja la capacidad para reproducir en la imagen los detalles finos del objeto. El límite de resolución (D) de un instrumento óptico es la distancia mínima a la que pueden estar separados dos puntos del objeto de tal modo que sean percibidos en la imagen como dos puntos independientes. Si la distancia entre dos puntos del objeto es menor que el límite de resolución del instrumento serán percibidos en la imagen como un punto único. Dicho límite de resolución se calcula mediante la fórmula2,4,6:

    siendo 0,61 una constante obtenida mediante cálculos físicos de la teoría de la difracción según el criterio de Rayleigh, λ la longitud de onda de la fuente de luz y AN la apertura numérica del instrumento (objetivo). A su vez la apertura numérica (AN) corresponde a2,4:

    siendo n el índice de refracción del medio (1 para el aire y 1,51 para el aceite de inmersión) y α el semiángulo de apertura (fig. 4) subtendido por el cono luminoso respecto a la normal (eje óptico). En la práctica, el límite superior de AN para objetivos secos (índice de refracción del aire n=1) es de 0,957, correspondiente a un ángulo de 72°. Para objetivos de inmersión de alto rendimiento con aceites de inmersión especiales se pueden alcanzar valores de hasta 1,6 (en la práctica hasta 1,4)2,7,8. El poder de resolución Pr de un instrumento óptico es el inverso del límite de resolución.

    Figura 4.

    Representación gráfica de cómo el diafragma de apertura (DA) modifica el ángulo de incidencia del cono de luz y con él la apertura numérica (AN) y el poder de resolución. A) El DA se halla abierto por encima del límite de AN del objetivo. Es decir, el condensador genera un cono de luz con un ángulo de incidencia en la preparación (β) y en el objetivo superior al ángulo máximo que puede aceptar dicho objetivo (ángulo α) y que determina su máxima AN. La AN del condensador (determinada por el ángulo β) excede a la AN del objetivo de tal modo que los rayos luminosos situados en la periferia del cono de luz no pueden ser recolectados por este y no son utilizados para la formación de la imagen. En esta situación la resolución es máxima por cuanto que se alcanza (de hecho se supera) el ángulo máximo para el que ha sido diseñado ese objetivo. En visión conoscópica no es visible la imagen del DA dado que este se sitúa por fuera del límite del campo de visión. B) El DA se ha cerrado hasta el límite de apertura numérica del objetivo de forma que los ángulos β’ y α’ subtendidos por el cono de luz, cuyos senos determinan la AN del condensador y del objetivo respectivamente, son iguales al ángulo máximo α aceptable por este objetivo. Por tanto, el poder de resolución es igualmente máximo. En visión conoscópica, la imagen del DA se sitúa en el borde del campo de visión. C) El DA se encuentra cerrado por debajo del límite de AN del objetivo. Los ángulos β“y α” son iguales entre sí (y por tanto las AN de condensador y objetivo) pero inferiores al ángulo máximo α. En esta situación no se utiliza todo el potencial del objetivo, en cuanto a resolución se refiere. No obstante, se produce un incremento del contraste y de la profundidad de campo que pueden compensar favorablemente la pérdida de resolución. En visión conoscópica, la imagen del DA se sitúa dentro del campo de visión ocultando la periferia del mismo.

    De las fórmulas anteriores se deduce que cuanto mayor sea la AN, menor va a ser el límite de resolución, mayor va ser el poder de resolución del instrumento y mejor va ser la «calidad óptica» de la imagen obtenida. En resumen, cuanto mayor AN mayor poder de resolución. La resolución del microscopio depende principalmente de la resolución del objetivo y la AN máxima del objetivo es un valor que viene inscrito en su superficie externa. Podemos modificar la AN del objetivo (y por tanto su poder de resolución) modificando el índice de refracción del medio (por ejemplo utilizando aceite de inmersión que al tener un índice de refracción mayor que el del aire aumenta la AN, en objetivos específicamente diseñados para ello) o modificando el semiángulo de apertura a través del DA (fig. 4).

    Para obtener la máxima AN del objetivo es necesario que la AN del condensador sea igual o superior a la del objetivo (fig. 4A y B). Para objetivos secos la AN habitual de la mayoría de los condensadores (0,9 o superior) es suficiente. Sin embargo, en objetivos de inmersión con aperturas numéricas por encima de 1, sería necesaria también la colocación de aceite de inmersión entre el condensador y la preparación histológica, para obtener la máxima resolución posible del objetivo2 (en la práctica habitualmente no es necesario).

    No es posible superar la AN máxima para la que ha sido diseñado cada objetivo. Sin embargo, mediante el DA sí es posible disminuir la AN modificando el ángulo de incidencia del cono de iluminación (fig. 4C). Como hemos venido comentando, al cerrar dicho diafragma, estamos disminuyendo la AN del objetivo y por tanto la resolución de la imagen. Sin embargo observamos que además se modifican otros parámetros como el contraste, la luminosidad de la imagen y la profundidad de campo.

    Uno de los parámetros más importantes de la calidad y nitidez de la imagen percibida es el contraste. Con el DA completamente abierto, y por tanto con el máximo poder de resolución, las imágenes aparecen como lavadas, desvaídas, con poco contraste6 (fig. 5A). Conforme cerramos el DA se va incrementando el contraste con una mejora sustancial de la calidad de imagen, a pesar de la pérdida de poder de resolución (fig. 5B). No obstante, esta mejoría tiene un límite debido a que si cerramos excesivamente dicho diafragma van a aparecer artefactos de difracción y de refracción, que pueden deteriorar la imagen hasta un nivel inaceptable (fig. 5C).

    Figura 5.

    Compromiso entre resolución y contraste. A) Diafragma de apertura (DA) muy abierto (100% del diámetro del campo) que condiciona máxima resolución y bajo contraste. B) Apertura óptima del DA (80%) con ligera disminución de resolución y buen contraste. C) Cierre excesivo del DA (inferior al 50%) con baja resolución y excesivo contraste.

    Por tanto, para una calidad óptima de la imagen es necesario un compromiso adecuado entre resolución y contraste6 (fig. 5). De manera general, se aconseja que se cierre el DA de tal forma que la imagen de este deje visible aproximadamente el 75% (entre el 66 y 90%) del diámetro del campo de visión en cada objetivo. Este ajuste se puede verificar objetivamente mediante visión conoscópica, retirando uno de los oculares y mirando directamente a través del tubo de inserción del mismo a una distancia aproximada de 20 cm. El valor exacto de la apertura óptima variará dependiendo de las propiedades refractivas/difractivas/absortivas6 de cada muestra. Lógicamente, resulta poco práctico tener que verificar mediante la retirada del ocular la apertura del diafragma cada vez que se cambie de objetivo. Con un poco de práctica rápidamente se aprende a ajustar la apertura del diafragma, de forma casi instintiva, simplemente en función de la modificación de la imagen ortoscópica (o normal). El aumento del contraste al cerrar el DA es debido al bloqueo de la luz dispersada procedente de la periferia de las lentes, al incremento de la coherencia de la luz y al aumento del tamaño de los puntos de difracción5.

    El DC controla el diámetro del haz de luz que atraviesa la preparación histológica mientras que el DA modifica el ángulo del cono de luz incidente en la muestra y en el objetivo2,6. Por tanto, al cerrar el DA, en visión normal (ortoscópica), no se altera el tamaño del campo de visión, al tratarse de un DA y a diferencia de lo que sucede con el DC, pero sí se modifica la luminosidad o brillo de la imagen, que disminuye. El brillo de la imagen (B), en el modo de transiluminación, es directamente proporcional al cuadrado de la AN del objetivo7 e inversamente proporcional al cuadrado del aumento que proporciona (M)2:

    A igualdad de aumentos es más «luminoso» un objetivo con mayor AN. No obstante, no debe utilizarse el DA (ni la altura del condensador) para modificar la intensidad lumínica2,5,6 dado que también se alteran otros parámetros. La intensidad de la luz debe ajustarse, a un nivel confortable, mediante el voltímetro o mediante el uso de filtros de densidad neutra (especialmente en microfotografía para no modificar la temperatura de color)2,6.

    Finalmente, otro de los parámetros que puede ser modificado mediante el DA es la profundidad de campo. Esta se define como la distancia axial (medida verticalmente sobre el eje óptico) que existe entre el plano objeto enfocado aceptablemente más próximo al objetivo y el plano objeto más alejado también simultáneamente en foco2,6. Todos los elementos situados en este intervalo se encontrarán igualmente enfocados. La profundidad de campo se calcula mediante la fórmula7:

    siendo λ la longitud de onda de la luz empleada, n el índice de refracción del medio entre la preparación y el objetivo, AN la apertura numérica del objetivo, M los aumentos (aumento lateral) del objetivo y e la menor distancia que puede ser resuelta por un detector colocado en el plano imagen del objetivo. La profundidad de campo total es la suma de las profundidades de campo dependientes tanto de parámetros derivados de la óptica ondulatoria (primer término del lado derecho de la ecuación, que determina principalmente la profundidad de campo de objetivos con elevada AN) como de la óptica geométrica (segundo término de la ecuación, que condiciona en mayor medida la profundidad de campo en objetivos de baja AN)7. De la fórmula anterior se deduce que la profundidad de campo es inversamente proporcional a la AN y por tanto al cerrar el DA aumentamos la profundidad de campo.

    En resumen, al abrir el DA, a través de la AN, aumentan la resolución y el brillo (luminosidad) de la imagen y disminuye el contraste y la profundidad de campo. Al contrario, al cerrar el DA aumentan el contraste y la profundidad de campo disminuyendo la resolución y el brillo de la imagen.

Cada vez que se cambie de objetivo, para optimizar la calidad de la imagen, es necesario reajustar el diámetro del DC y del DA. Por ejemplo, al pasar a un objetivo de mayor aumento (por ejemplo de 10x a 40x) se produce una disminución del diámetro del campo de visión por lo que será necesario cerrar el DC hasta el límite del nuevo campo visual. Sin embargo, con objetivos de mayores aumentos también aumenta la AN por lo que será necesario abrir el DA hasta el nivel deseado (como se mencionó, de manera general entre el 66 y el 90% del diámetro del campo de visión). En este sentido, muchos diafragmas de apertura incorporan en su diseño una escala graduada que refleja la AN del condensador en función de la apertura de su diafragma. Anotando o memorizando el valor óptimo de dicha escala para cada objetivo (dicho valor puede variar, no obstante, dependiendo de las características de la preparación histológica) se puede restablecer rápidamente, y sin necesidad de extraer el ocular, la apertura óptima del diafragma del condensador. Por ejemplo, si estamos utilizando un objetivo con una AN de 0,25 y deseamos iluminar el 80% del diámetro del campo en visión conoscópica, situaremos la apertura del diafragma según la escala en 0,2 (0,2 es el 80% de 0,25)2.

Todos estos ajustes necesarios para establecer las condiciones ópticas óptimas para el sistema de iluminación de Köhler aparentemente suponen un procedimiento farragoso y que conlleva un considerable consumo de tiempo. Sin embargo, la mayor parte de los ajustes mencionados no es necesario que sean realizados cada vez que utilicemos el microscopio. Con un poco de práctica dichos ajustes se realizan de forma casi instintiva y en muy corto espacio de tiempo, compensando, sobradamente, la mejora en la calidad de la imagen el tiempo consumido. Todos estos ajustes, básicamente, se resumen en:

  • 1.

    Enfocar la preparación.

  • 2.

    Enfocar y centrar el condensador a través de la imagen del DC.

  • 3.

    Ajustar el DA.

  • 4.

    Al cambiar de objetivo reajustar los diafragmas de campo y de apertura.

Microscopía de bajos aumentos

Los condensadores habitualmente están diseñados para trabajar en un determinado rango de aperturas numéricas, parámetro a su vez muy relacionado, habitualmente, con los aumentos del objetivo. Los ajustes para el sistema de iluminación de Köhler, que hemos venido comentando hasta ahora, son de aplicación cuando se trabaja con objetivos de grandes aumentos (10x en adelante). Sin embargo en microscopía de bajos aumentos (2x a 5x) los objetivos tienen aperturas numéricas considerablemente menores siendo necesario ajustar, en consonancia, la AN del condensador. En caso contrario se reduce sustancialmente el campo de visión. Al insertar en la vía óptica estos objetivos de bajos aumentos es preciso cambiar el condensador utilizado por otro de mayor distancia focal. Sin embargo, muchos microscopios vienen equipados con condensadores que incluyen una lente superior abatible que cuando se retira de la vía óptica permiten la microscopía de bajos aumentos de forma satisfactoria. Para objetivos de muy bajos aumentos (1x, 1,5x) es imprescindible usar condensadores específicos.

Sin embargo, hay que tomar en consideración que al abatir la lente superior del condensador cambia radicalmente el comportamiento óptico de otros elementos del microscopio6. Dejan de ser aplicables las condiciones ópticas para el sistema de iluminación de Köhler. La imagen del DC no se forma en el plano de la preparación histológica y no puede ser utilizada para el centrado del condensador y ajuste de su altura. Los ajustes para la iluminación de Köhler deben ser realizados, del modo descrito anteriormente, con el objetivo de 10x, previamente a la retirada de la lente superior del condensador. Posteriormente no debe modificarse la altura del mismo.

El DA del condensador deja de controlar la AN del microscopio. De hecho, debe abrirse completamente para evitar fenómenos de viñeteado6 (oscurecimiento progresivo de la imagen en el borde del campo visual).

El DC situado en la base del microscopio deja de comportarse como un diafragma de campo y ya no limita el área de visión (de iluminación) de la preparación histológica. Este diafragma situado en la base del microscopio (de campo con la lente superior insertada) se convierte en un diafragma de apertura regulando el ángulo de apertura y mediante él, la AN, la resolución, el contraste, el brillo y la profundidad de campo. Nuevamente es necesario un compromiso entre resolución y contraste modificando el diámetro del diafragma situado en la base. Si este diafragma se encuentra completamente abierto, la resolución es máxima pero las imágenes aparecen desvaídas, lavadas, con poco contraste. De manera genérica, se recomienda una apertura de dicho diafragma de tal modo que deje visible entre el 50 y el 80% del diámetro del campo visual6. Este ajuste se puede verificar mediante visión conoscópica (retirando el ocular) en la apertura posterior del objetivo puesto que, con la lente superior del condensador abatida, el diafragma de la base del microscopio se hace visible a este nivel.

Recursos web recomendados

Olympus Microscopy Resource Center. http://www.olympusmicro.com/

Nikon's MicroscopyU website. https://www.microscopyu.com/

ZEISS Microscopy Online Campus | Basic Concepts in Microscopy. http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/

Basics in Microscopy: Leica Science Lab - Leica Microsystems. http://www.leica-microsystems.com/science-lab/topics/basics-in-microscopy/

Responsabilidades éticasProtección de personas y animales

Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.

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Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke
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Autor para correspondencia.
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