La inflamación es un componente principal de los aneurismas aórticos abdominales (AAA). El gen estimulado por interferón 15 (ISG15) tiene un papel en el AAA. Se han investigado los mecanismos por los cuales ISG15 podría participar en el remodelado y en la función vasculares.
MétodosSe utilizaron células musculares lisas (CMLV) de ratones control (ISG15+/+) o deficientes en ISG15 (ISG15−/−), aortas procedentes de ratones ISG15+/+ o ISG15−/− infundidos o no con angiotensina II (Ang II, 1,44mg/kg/día, sc, 14 días) y muestras de AAA humanos. Se realizó un modelo de infusión de proteína ISG15 recombinante (ISG15r, sc, 100 y 500ng/día, 14 días) en ratones.
ResultadosEn CMLV la deficiencia de ISG15 aumentó la expresión de marcadores de fenotipo contráctil (Acta2, Tagln) y sintético (Fn1, Col1a2, Col3, Col4) y disminuyó la del marcador de fenotipo calcificante Spp1. Ang II moduló la expresión de marcadores de fenotipo de manera diferente en aorta de ratones ISG15+/+ e ISG15−/−. La expresión de ISG15 correlacionó negativamente con la expresión de marcadores contráctiles (ACTA2, CNN1), así como con COL3a1, en muestras humanas procedentes de pacientes con AAA o con patología estenosante aorto-iliaca. ISG15r indujo un remodelado vascular hipotrófico en arterias mesentéricas sin afectar a la mecánica vascular. La aorta de los ratones ISG15−/− contrajo más al análogo de tromboxano A2 U46619, comparada con los ratones ISG15−/−. La aorta y las arterias mesentéricas de los ratones infundidos con ISG15r muestran menor contractilidad que los ratones controles.
ConclusionesISG15 participa en el remodelado vascular patológico posiblemente por su papel en el control del fenotipo de las CMLV. Dichos cambios podrían además impactar en la función vascular.
Inflammation is a major determinant of abdominal aortic aneurysms (AAA). Interferon stimulated gene 15 (ISG15) has a role in vascular remodelling in AAA. This study investigates the mechanisms whereby ISG15 might affect vascular remodeling and function.
MethodsWe used vascular smooth muscle cells (VSMC) from wild type (ISG15+/+) o ISG15 knockout (ISG15−/−) mice, aorta from ISG15+/+ and ISG15−/− mice infused with angiotensin II (1.44mg/kg/day, sc, 14 days), and human AAA. We also performed a model of recombinant ISG15 infusion (rISG15, sc, 100 and 500ng/day, 14 days) in mice.
ResultsIn VSMC, ISG15 deficiency increased the expression of contractile (Acta2, Tagln) and synthetic (Fn1, Col1a2, Col3, Col4) markers and decreased the expression of the calcification marker Spp1. Ang II infusion changed the expression of phenotype markers differently in aorta from ISG15+/+ or ISG15−/− mice. ISG15 expression showed a negative correlation with expression of contractile markers (ACTA2, CNN1), and with COL3a1, in human samples from patients with AAA or with stenotic aorto-iliac pathology. rISG15 infusion induced hypotrophic vascular remodelling in mesenteric arteries without affecting vascular mechanics. Aorta of ISG15−/− mice contracted more to thromboxane A2 analogue U46619, compared to ISG15−/−mice. Both aorta and mesenteric arteries from rISG15-treated mice showed less contractility than control mice.
ConclusionsISG15 participates in pathological vascular remodeling probably by modulating VSMC phenotype. These changes could also impact in the vascular function.
El remodelado vascular es un proceso activo que implica cambios en el crecimiento, la muerte o la migración de las células musculares lisas vasculares (CMLV) y en la síntesis, reorganización o degradación de la matriz extracelular (MEC)1 y que se produce en respuesta a cambios a largo plazo en las condiciones hemodinámicas, lo que contribuye a la fisiopatología de las enfermedades vasculares1. Entre las distintas condiciones clínicas donde se presenta el remodelado, los aneurismas aórticos abdominales (AAA) son una de las más devastadoras2. Los AAA son una patología vascular fundamentalmente asintomática y potencialmente letal que se caracteriza por una dilatación permanente de la aorta de más de 3cm3,4. Los factores de riesgo asociados a los AAA incluyen tabaquismo, edad avanzada, sexo masculino, antecedentes familiares de AAA, enfermedad arterial periférica, hipertensión, presencia de aneurismas de la aorta en otras localizaciones, raza y dislipemia3,4. Entre los mecanismos comúnmente implicados en el desarrollo de los AAA se encuentran la inflamación vascular, la modificación del fenotipo de las CMLV y diversas alteraciones en las proteínas de la MEC4, que además juegan un papel fundamental en la contracción vascular.
Las CMLV son un tipo celular dinámico con capacidad de alternar entre distintos fenotipos funcionalmente diferentes5. En el AAA, se ha descrito la presencia de CMLV de diversos fenotipos. Así, los AAA presentan, en general, una disminución de CMLV de fenotipo contráctil y un aumento de CMLV secretoras, senescentes o proinflamatorias que contribuyen a la dilatación de la pared vascular y que podrían tener impacto en la funcionalidad de la misma6,7. Las CMLV proinflamatorias presentan un aumento en la producción de distintas citoquinas como interleucina (IL)1β, factor de necrosis tumoral (TNF), IL6 y elevada expresión de metaloproteinasas (MMP2 y 9), que permite el infiltrado de células del sistema inmune como células T, macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células B y mastocitos8 que perpetúan el ciclo inflamatorio vascular9.
El AAA se asocia a un aumento en la expresión de diversos mediadores inflamatorios10–12. Los niveles de IFNγ se encuentran aumentados tanto en modelos animales de AAA como en el aneurisma humano12–17, y existen estudios recientes que parecen sugerir un posible papel de los IFNs de tipo I en la patología del aneurisma18. En este sentido, recientemente se ha detectado la presencia de un subtipo único de macrófagos inducidos por IFN que participa en la formación y ruptura de AAA19.
La señalización de los IFNs induce una cascada de señalización que da lugar a la expresión de diversos genes estimulados por interferón (ISGs, interferon stimulated genes). ISG15 codifica una proteína similar a la ubiquitina que se expresa principalmente en células del sistema inmune20–22. La proteína ISG15 puede encontrarse en forma libre o conjugada a proteínas sustrato, induciendo una modificación postraduccional reversible en las proteínas recién sintetizadas denominada ISGilación. Tanto ISG15 como las enzimas implicadas en la ISGilación se inducen en respuesta a diferentes IFNs, así como en respuesta a lipopolisacáridos o TNFα23,24. Mientras que la ISGilación parece modular procesos como las infecciones virales, la progresión del cáncer, la respuesta a hipoxia o la secreción de exosomas25–28, la función de ISG15 libre es menos conocida y parece estar relacionada con la modulación de la actividad de células inmunes18,19,25–28.
A nivel vascular el papel de ISG15 es muy poco conocido. Se ha encontrado ISG15 en exosomas liberados por células microvasculares endoteliales humanas en el contexto de la infección por el VIH29. Además, ISG15 parece tener un papel en el remodelado vascular. Así, en una cohorte de individuos con factores de riesgo cardiovascular como hipertensión o diabetes, se encontró una correlación positiva entre la expresión de ISG15 y el grosor íntima-media carotídeo30. Además, se ha sugerido un posible papel de ISG15 en aterosclerosis31. En el contexto del aneurisma de aorta, se demostró que la expresión de ISG15 fue mayor en dos modelos murinos de aneurisma y en aneurismas humanos comparados con ratones controles y pacientes sin aneurisma30,32. Además, ratones que portan una mutación en la enzima de-isigiladora USP18, que inhibe su actividad proteasa, desarrollan aneurisma de aorta tras la infusión de angiotensina II (Ang II)30. Sin embargo, los mecanismos responsables del papel de ISG15 en el remodelado vascular patológico no son del todo conocidos. El objetivo de este estudio es analizar el papel de ISG15 en el fenotipo de las CMLV, así como su posible contribución en el remodelado y función vasculares.
Material y métodosModelos animalesLos estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética para la Investigación de la Universidad Autónoma de Madrid (UAM) y por la Dirección General de Medio Ambiente, Comunidad de Madrid, España (PROEX 345/14 and 183.2/20). Los animales fueron atendidos de acuerdo a la Ley española de Protección Animal RD53/2013, la cual incluye la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE para la protección de animales para uso experimental y otros propósitos científicos. Los experimentos con animales se adhirieron a las directrices del ARRIVE.
Se utilizaron ratones macho C57BL/6J de genotipo silvestre (ISG15+/+) y deficientes en ISG15 (ISG15−/−)30 amablemente cedidos por el Dr. Klaus-Peter Knobeloch (Universidad de Freiburg, Alemania) de 13-15 semanas de edad que fueron estabulados en el animalario convencional de la UAM bajo condiciones controladas de temperatura y humedad, alimentados con una dieta estándar, acceso a bebida at libitum y ciclos de luz/oscuridad de 12h. Ambos grupos de ratones fueron tratados con AngII (1,44mg/kg/día, 14 días) administrada subcutáneamente en minibombas osmóticas Alzet (modelo 2002, Durect Corp., Cupertino, CA, EE.UU.) implantadas bajo anestesia con isoflurano (2%).
En otro grupo de experimentos, se dividió aleatoriamente a ratones C57BL/6J en tres grupos: control e infundidos con ISG15 recombinante (ISG15r humana, catálogo 12729-HNAE, Sino Biological, Alemania) a las dosis de 100 y 500ng/día mediante bombas de liberación continuada (Alzet 2002) y durante 14 días.
Preparación de los tejidosLa eutanasia de los ratones fue realizada por inhalación con CO2. Inmediatamente tras el sacrificio, se aislaron la aorta y las ramas de primer orden distales a la arteria mesentérica superior que se limpiaron de grasa y tejido conectivo en una solución Krebs-Henseleit (KHS) fría (4°C) (115mM NaCl, 25mM NaHCO3, 4,7mM KCl, 1,2mM MgSO4.7H2O, 2,5mM CaCl2, 1,2mM KH2PO4, 11,1mM glucosa, y 0,01mM Na2EDTA). El análisis de la función vascular y las propiedades estructurales y mecánicas se realizó el mismo día del sacrificio.
Cultivo de células musculares lisas vascularesSe obtuvieron CMLV procedentes de aortas de ratones ISG15+/+ e ISG15−/− de 2 meses de edad. Para ello, las aortas se sumergieron en PBS frío para eliminar el tejido conectivo y la grasa. Las aortas se incubaron durante 45min a 37°C en medio DMEM sin suero que contenía 2mg/ml de colagenasa tipo 2, l-glutamina (10mmol/L), y antibióticos (penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100μg/ml) en una atmosfera con 95% de aire y 5% de CO2. A continuación, se cortaron las aortas en pequeños anillos y los explantes se sembraron en DMEM con un 20% de suero fetal bovino. Posteriormente las células fueron tripsinizadas y subcultivadas. Para el análisis de los marcadores de fenotipo, las CMLV se ayunaron con medio libre de suero durante 24h. Todos los experimentos se realizaron entre los pases 3 y 7.
Muestras humanasLos estudios en humanos se realizaron de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fueron aprobados por el Comité de Ética e Investigación del Hospital Universitario La Princesa (Madrid, España) (protocolo PI-825). Las características de los pacientes aparecen en la tabla 1. Participaron en el estudio pacientes mayores de 18 años, con AAA o patología oclusiva aorto-iliaca (no-AAA). Todos los pacientes eran conscientes de la naturaleza investigadora del estudio y dieron su consentimiento informado por escrito. Se reclutaron para el estudio pacientes candidatos a cirugía abierta, independientemente de su estado sintomático, con AAA de 5,5cm o más de diámetro máximo (5cm o más en las mujeres), medido mediante técnicas de imagen (ecografía-Doppler o tomografía axial computarizada), o que durante el seguimiento experimentaran un crecimiento rápido (más de 0,5cm/semestre). Se consideraron criterios de exclusión las afecciones inflamatorias y neoplásicas activas, las enfermedades autoinmunes, la serología positiva para el VIH, el embarazo y el consumo de drogas recreativas. Se obtuvieron muestras de pared aórtica de 34 pacientes, 27 de ellos con AAA (diámetro >5,5cm) y 7 con patología aórtica no aneurismática (diámetro<3,0cm) en el momento de la cirugía abierta en la Unidad de Angiología y Cirugía Vascular del Hospital Universitario La Princesa. Las muestras fueron almacenadas a −80°C para estudios de expresión génica mediante análisis q-PCR.
Características clínicas de los pacientes que sufrieron cirugía abierta para la reparación del aneurisma aórtico abdominal (AAA) o la patología aorto-iliaca (no-AAA)
| No-AAA | AAA | |
|---|---|---|
| Número de muestras | 7 | 27 |
| Edad (años) | 68,71±2,69 | 70,65±1,44 |
| Género (masculino/femenino) | 7/0 | 25/2 |
| Peso corporal (kg) | 66,86±3,67 | 88,19±2,86* |
| Altura (m) | 1,70±0,02 | 1,71±0,01 |
| Índice de masa corporal (kg/m2) | 23,3±1,49 | 29,95±0,97* |
| Perímetro abdominal (cm) | 89,60±10,95 | 113,4±2,43* |
| Diabetes mellitus (%) | 14% | 16% |
| Hipertensión (%) | 43% | 60% |
| Dislipidemia (%) | 28% | 56% |
| *Cardiopatías (%) | 28% | 40% |
| ERC (%) | 0% | 28% |
| Fumador (%) | 100% | 88% |
| EPOC | 14% | 24% |
| Ictus | 0% | 12% |
| Enfermedad periférica vascular | 71% | 16%* |
| Medicación | ||
| Antidiabético | 0% | 12% |
| Insulina | 0% | 0% |
| Antihipertensiva | 43% | 62% |
| Estatinas | 43% | 75% |
| Antiagregante | 43% | 50% |
| Anticoagulante | 14% | 21% |
| Betabloqueantes | 28% | 29% |
Los valores están expresados como media±SEM, número de sujetos o porcentajes. Las cardiopatías incluyen enfermedad congénita, cardiomiopatía isquémica, cardiopatía valvular, insuficiencia cardiaca, arritmia, cardiomiopatía dilatada, cirugía abierta cardiaca, procedimiento endovascular coronario previo.
EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica; ERC: enfermedad renal crónica.
*p<0,05 vs. no-AAA.
El ARN total se obtuvo utilizando TRI Reagent® (Sigma-Aldrich, n° de cat. T9424) siguiendo las recomendaciones del fabricante. El ARN se transcribió a ADNc mediante el kit de síntesis de ADNc de primera cadena NZY (Nzytech). El nivel de expresión del ARNm se analizó mediante PCR en tiempo real (q-PCR) en un sistema ABI 7500 Fast (Invitrogen Life Technologies), utilizando cebadores específicos personalizados (Sigma-Aldrich) o sondas prediseñadas proporcionados por el sistema Assay-on-Demand (Applied Biosystems) o por Integrated DNA Technologies (Illinois, EE.UU.) (tabla 2). El control de normalización fue 18S para las RT.PCR multiplex y β-actina para las restantes. Se utilizó el método de 2-ΔΔCt para calcular los niveles relativos de expresión de ARNm.
Cebadores o sondas utilizadas en los estudios de expresión de ARNm
| Humano | |||
| ACTB | Beta-Actina | NM_001101 | F: 5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC |
| R: 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG | |||
| ACTA2 | Actina alfa 2, músculo liso | NM_001613 | F: 5’TCGTTACTACTGCTGAGCGTGAGA |
| R:5’ AAGGATGGCTGGAACAGGGTC | |||
| CNN1 | Calponina | NM_001299 | Hs.PT.58.38799164 |
| COL1a2 | Colágeno 1 alfa 2 | NM_000089 | F: 5’-CAGCCGCTTCACCTACAG |
| R: 5’-AATCACTGTCTTGCCCCAGG | |||
| COL3a1 | Colágeno 3a1 | NM_000090 | Hs.PT.58.4249241 |
| CCN2 | Factor de crecimiento derivado de tejido conectivo | NM_001901 | Hs.PT.58.14485164.g |
| ISG15 | ISG15 modificador similar a ubiquitina | NM_005101 | Hs.PT.58.39185901.g |
| SPP1 | Osteopontina | NM_000582 | Hs.PT.58.19252426 |
| RNA18S1 | 18S ribosomal 1 | X03205 | 4310893E |
| Ratón | |||
| Acta2 | Actina alfa 2, músculo liso | NM_007392 | Mm.PT.58.16320644 |
| Col1a2 | Colágeno1 alfa 2 | NM_007743 | F: 5‘-GTCCTAGTCGATGGCTGCCTC3 |
| R: 5‘-AGCACCACCAATGTCCAGAG3 | |||
| Col3 | Colágeno 3 alfa 1 | NM_009930 | Mm.PT.58.13848686 |
| Col4 | Colágeno 4 alfa 1 | NM_009931 | Mm.PT.58.31838522 |
| Fn1 | Fibronectina 1 | NM_001276408 | F: 5‘-ATGAGAAGCCTGGATCCCCT3 |
| R: 5‘-GGAAGGGTAACCAGTTGGGG3 | |||
| Klf4 | Factor 4 similar a Krueppel | NM_010637 | Mm.PT.58.10779296 |
| Spp1 | Osteopontina | NM_001204201 | Mm.PT.58.43709208 |
| Tgln2 | Transgelina | NM_178598 | Mm.PT.58.28725952 |
Las aortas de los modelos animales se fijaron, deshidrataron, embebieron en parafina y se cortaron a 5μm de grosor para después teñirlas con hematoxilina-eosina para la evaluación de la estructura vascular. El análisis se realizó con el programa Image J (Image J, NIH, Bethesda, MD, EE.UU.).
Miógrafo de presiónLas propiedades estructurales y mecánicas de las arterias mesentéricas se estudiaron en un miógrafo de presión (Danish Myo Tech, Modelo P100, J.P. Trading I/S). Las arterias limpias se montaron en dos microcánulas de vidrio y se fijaron con sutura quirúrgica de nailon. Después de anudar las pequeñas ramificaciones, se ajustó la longitud de los vasos para que sus paredes quedaran paralelas sin estirarse. A continuación, el segmento se ajustó a una presión de 45mmHg y se dejó equilibrar durante 30min a 37°C en KHS libre de calcio (0Ca2+; omitiendo el calcio y añadiendo 1mmol/L de EGTA) perfundido intravascular y extravascularmente. Se obtuvo una curva presión-diámetro aumentando la presión intraluminal en pasos de 20mmHg desde 3 a 120mmHg durante 2min en cada presión. En cada paso, se tomó una fotografía durante los últimos 30s, cuando las medidas eran estables. Las medidas de los diámetros interno (Di0Ca) y externo (De0Ca) se realizaron a cada presión intraluminal en al menos tres puntos diferentes utilizando el software de análisis Image J.
Los parámetros estructurales de la pared del vaso se calcularon de la siguiente manera:
Grosor de la pared=(De0Ca–Di0Ca)/2
Relación pared/luz=(De0Ca–Di0Ca)/2Di0Ca
Área de la sección transversal=π/4 ((De0Ca)2–(Di0Ca)2)
Los parámetros mecánicos se calcularon utilizando las siguientes fórmulas:
Deformación=(Di0Ca–D00Ca)/D00Ca donde D00Ca es el diámetro interno a 3mm Hg.
Estrés circunferencial=(P×Di0Ca)/(2GP), donde P es la presión intraluminal (1mmHg=1.334×103 dinasxcm–2) y GP es el grosor de la pared a cada presión intraluminal.
Distensibilidad incremental=ΔDi0Ca/(Di0Ca×ΔP)×100
La rigidez arterial independiente de la geometría se determinó por el módulo elástico de Young (E=estrés/deformación). Esta relación no es lineal, por lo que es más apropiado obtener la pendiente de la curva estrés/deformación (β) la cual se obtuvo ajustando los datos de cada animal a una curva exponencial30.
Microscopia confocalArterias mesentéricas intactas fijadas obtenidas del miógrafo de presión se incubaron con el colorante nuclear Hoechst 33342 (0,01mg/mL; Thermo Fisher Scientific) durante 15min. A continuación, las arterias se montaron en portas con pocillos de silicona para visualizarse en un microscopio confocal Leica TCS SP5. Se tomaron al menos dos secciones ópticas de 0,5μm de grosor a lo largo de la arteria y se cuantificó el número de CMLV usando Image J.
Función vascularSe montaron segmentos de 2mm de aorta y de arteria mesentérica en un miógrafo de alambres (Danish MyoTech, Aarhus, Dinamarca). Las arterias se equilibraron primero durante 30min en KHS oxigenado burbujeado continuamente con 95% de O2 y 5% de CO2, y después se estiraron hasta su diámetro óptimo interno para el desarrollo de tensión activa. Para comprobar la integridad funcional de los segmentos arteriales, se realizó una exposición inicial a una solución con alto contenido en K+ (120mmol/L KCl). A continuación, se realizaron curvas de concentración-respuesta para fenilefrina (1nmol/L - 30μmol/L; Sigma-Aldrich) y el análogo del tromboxano A2, U46619 (0,1nmol/L - 1μmol/L; Cayman Chemical, EE.UU.) en arterias con el endotelio intacto. Los datos fueron adquiridos y analizados con el programa LabChart® (ADInstruments, New South Wales, Australia). Las respuestas vasoconstrictoras fueron expresadas como mN/mm.
Análisis de datos y estadísticaLos datos se analizaron mediante el programa Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, Inc, San Diego, CA, EE.UU.). Todos los datos se expresaron como media±error estándar de la media del número de animales o pacientes. Tras comprobar la normalidad de la distribución de las poblaciones mediante un test de Shapiro-Wilk, las diferencias entre poblaciones se determinaron mediante un test paramétrico no pareado (t-test de Student), o su correspondiente test no paramétrico (Mann-Whitney). Se aplicó un test de medidas repetidas según el procedimiento del modelo lineal general o un Anova de dos vías en los datos de estructura, mecánica y función vascular seguido de un postest de Bonferroni. Los análisis de correlación se realizaron mediante test de correlación de Spearman. En todos los casos se consideró una p<0,05 como estadísticamente significativa.
ResultadosPapel de ISG15 en el fenotipo de las células musculares lisas vascularesLa expresión del ARNm de ISG15 está aumentada en muestras de aneurismas murinos y humanos30,32. Además, los ratones con un aumento en el proceso de ISGilación desarrollan AAA en respuesta a Ang II30. Para profundizar en los mecanismos por los cuales ISG15 podría inducir dicho remodelado, aislamos y cultivamos CMLV de ratones ISG15+/+ e ISG15−/− y analizamos cambios en la expresión de marcadores de fenotipo contráctil (Acta2, Tgln2), fenotipo sintético (Fn1, Col1a2, Col3, Col4) y de fenotipo calcificante o similar a osteoblasto (Spp1, Klf4). Las CMLV procedentes de ratones ISG15−/− presentan mayor expresión de marcadores de fenotipo contráctil y sintético y disminución de la expresión del marcador de fenotipo calcificante Spp1 comparadas con las de los ratones ISG15+/+ (fig. 1A).
ISG15 modula el fenotipo de las células musculares lisas vasculares (CMLV). (A) Niveles de expresión del ARNm de marcadores de fenotipo contráctil (Acta2, Tgln2), sintético (Fn1, Col1a2, Col3, Col4) o calcificante (Spp1, Klf4) en CMLV procedentes de aorta de ratones ISG15+/+ e ISG15−/−. La n está representada por el número de puntos en cada caso y constituye cultivos independientes. *p<0,05 vs. ISG15+/+ por t test no pareado. (B) Niveles de expresión de marcadores de fenotipo contráctil (Acta2), sintético (Col3) y calcificante (Spp) en aorta de ratones ISG15+/+ e ISG15−/− tratados con angiotensina II durante 2 semanas. La n está representada por el número de puntos en cada caso y constituye distintos animales. *p<0,05 vs. control y +p<0,05 vs. ISG15+/+ por ANOVA de una vía.
A continuación, infundimos ratones ISG15+/+ e ISG15−/− con Ang II y medimos algunos de estos marcadores de fenotipo en aorta. Ang II redujo la expresión del gen Acta2 en ratones ISG15+/+, un efecto no observado en ratones ISG15−/−. Las aortas de ratones ISG15−/− mostraron menor expresión basal de Col3 que no se modificó con Ang II en ninguno de los dos genotipos. Ang II también incrementó la expresión de Spp1 en ratones ISG15+/+ y dicha expresión disminuyó en aortas de ratones ISG15−/− (fig. 1B).
La expresión de ISG15 correlaciona negativamente con marcadores contráctiles en muestras de aorta humanaA continuación, evaluamos la expresión de marcadores de fenotipo contráctil y sintético en muestras de AAA humanas y las comparamos con muestras de pacientes con patología aorto-iliaca sin AAA. Observamos que las muestras de AAA presentaban disminución en la expresión del marcador contráctil CNN1 y del marcador de calcificación SPP1 pero no otros marcadores sintéticos o contráctiles como ACTA2, CCN2, COL1a2 o COL3a1 (fig. 2A). Sin embargo, la expresión de ISG15 correlacionó negativamente con algunos marcadores como ACTA2, CNN1, y COL3a1 (fig. 2B, tabla 3), lo que sugiere un posible papel de ISG15 en el fenotipo de las CML en la patología vascular.
Expresión de genes relacionados con fenotipo en muestras humanas. (A) Niveles de expresión de ARNm de distintos marcadores de fenotipo contráctil (ACTA2 y CNN1), sintético (COL1a2, COL3a1, CCN2) o calcificante (SPP1) en muestras de aorta procedentes de pacientes con AAA o con aortopatía iliaca no aneurismática (No-AAA). (B) Correlación entre los niveles de expresión del ARNm de ISG15 y diversos marcadores contráctiles (ACTA2, CNN1) o sintéticos (COL3a1) en dichas muestras. El número de muestras está representado por el número de puntos en cada caso y representa distintos pacientes. *p<0,05 vs. ISG15+/+ por test de Mann-Whitney.
Para confirmar el efecto de ISG15 en la estructura vascular, realizamos un modelo de infusión de ISG15r en ratones durante 2 semanas. En aorta, ISG15r produjo una tendencia a disminuir los diámetros interno y externo y el grosor de la pared vascular particularmente a la dosis de 500ng/día (fig. 3A). La infusión de ISG15r produjo un aumento en la expresión génica de los marcadores Col3 y Spp1 y sin cambios en Acta2 a la dosis de 100ng/día (fig. 3B). A la dosis de 500ng/día, la expresión de dichos marcadores no cambiaron o incluso disminuyó para Col3 (fig. 3B). Además, ISG15r produjo un remodelado hipotrófico en arterias mesentéricas de resistencia a la dosis de 100ng/día caracterizado por una disminución de los diámetros externo e interno, del grosor de la pared y del área de la sección transversal (fig. 4A-E). La dosis de 500ng/día produjo una disminución del grosor de la pared, pero no afectó significativamente al resto de parámetros estudiados. Este remodelado inducido por ISG15r podría ser debido a cambios en el número de CMLV en la pared vascular, puesto que la visualización en 3D de las arterias mesentéricas con microscopia confocal mostró una tendencia a menor número de CMLV en las arterias de los ratones infundidos con ISG15r (fig. 4F).
Efecto de ISG15 recombinante (ISG15r) en la estructura vascular aórtica. (A) Imágenes representativas (objetivo ×10 y zoom 1) y cuantificación del diámetro y del grosor de la pared de secciones trasversales de aorta y (B) niveles de expresión aórtica del ARNm de marcadores de fenotipo contráctil (Acta2), sintético (Col3) o calcificante (Spp1), de ratones control e infundidos con ISG15r a las dosis de 100 y 500ng/día durante 14 días. El número de muestras está representado por el número de puntos en cada caso y representa distintos animales. *p<0,05 vs. ISG15+/+ por t test no pareado.
Efecto de ISG15 recombinante (ISG15r) en la estructura de arterias mesentéricas. Diámetro externo (A), diámetro interno (B), grosor de la pared (C), relación pared/luz (D) y área de la sección trasversal (E) de arterias mesentéricas procedentes de ratones C57BL6/J infundidos o no (control) con ISG15r a las dosis de 100 y 500ng/día durante 14 días. n=8; *p<0,05 vs. control por ANOVA de dos vías. (F) Número de células musculares lisas vasculares de arterias mesentéricas de ratones control o infundidos con ISG15r (100ng/día) obtenidos mediante microscopia confocal. n=8. La n está representada por el número de puntos en cada caso y constituye distintos animales.
A continuación, evaluamos posibles cambios en la mecánica vascular y observamos que la infusión de ISG15r no produjo cambios significativos en la deformación, el estrés, la distensibilidad o la relación estrés-deformación (un marcador de rigidez independiente de la geometría de la pared) a ninguna de las 2 dosis analizadas (fig. 5), lo que sugiere que los cambios encontrados en la estructura vascular de arterias mesentéricas de ratones infundidos con ISG15r son probablemente debidos a cambios en las células vasculares y no a la MEC.
Efecto de ISG15 recombinante (ISG15r) en la mecánica de arterias mesentéricas. Deformación (A), estrés circunferencial (B), distensibilidad incremental (C) y relación estrés-deformación (D) de arterias mesentéricas procedentes de ratones C57BL6/J infundidos o no (control) con ISG15r a las dosis de 100 y 500ng/día durante 14 días. n=8. El parámetro β representa la pendiente de la relación estrés-deformación. La n está representada por el número de puntos en cada caso y constituye distintos animales.
Cualquier cambio en la estructura de la pared vascular podría influir en su función. Por ello, evaluamos la capacidad contráctil de las arterias procedentes de ratones ISG15+/+ y ISG15−/−, así como las procedentes del modelo de infusión de ISG15r. Como se observa en la figura 6A, las aortas de ratones ISG15−/− no mostraron cambios en las respuestas a fenilefrina, pero se observó un aumento en la contracción al análogo del tromboxano A2, U46619. Por el contrario, la infusión de ISG15r produjo una disminución de las respuestas contráctiles a fenilefrina en aorta y en arterias mesentéricas concretamente a la dosis de 500ng/día (fig. 6B).
Papel de ISG15 en la contractilidad vascular. (A) Respuesta contráctil a fenilefrina (Phe) o al análogo de tromboxano A2, U46619 en segmentos de aorta procedentes de ratones ISG15+/+ e ISG15−/−. (B) Respuesta contráctil a fenilefrina (Phe) en segmentos de aorta y arterias mesentéricas procedentes de ratones C57BL6/J infundidos o no (control) con ISG15r a las dosis de 100 y 500ng/día durante 14 días. n=5-7. *p<0,05 vs. ISG15+/+ por ANOVA de dos vías vs. ISG15+/+ o ratones control.
El remodelado vascular es un factor clave en el desarrollo de las patologías como los AAA1,2. Puesto que los AAA son una enfermedad potencialmente letal y que no cuenta con un tratamiento profiláctico farmacológico efectivo2–4, profundizar en los mecanismos que participan en su desarrollo es crucial. En el AAA se ha descrito una infiltración de diversos tipos de células del sistema inmune, siendo los macrófagos las más abundantes10. Estas células inmunes infiltradas y las propias células vasculares liberan citoquinas proinflamatorias como IL6, TNF o IFNγ a nivel local y sistémico, cuyos niveles se correlacionan con el crecimiento o la rotura de los AAA10. Diversos estudios han implicado a los IFNs en el desarrollo de los AAA, si bien su papel no está completamente definido. Así, el IFNγ parece participar en la activación de metaloproteinasas, colagenasas y elastasas y de esta forma en la degradación de la matriz asociada a los AAA12–14. Además, recientemente se ha descrito que ISG15 participa en diversas alteraciones estructurales y mecánicas vasculares en el contexto de la hipertensión y el desarrollo de AAA30 y que su expresión se encuentra aumentada en muestras de AAA murinos y humanos32.
Uno de los mecanismos implicados en el desarrollo de los AAA es la alteración en el fenotipo de las CMLV, que se des-diferencian desde su estado sano contráctil, a fenotipos secretores, senescentes o proinflamatorios5–7. Nuestros datos muestran que las CMLV procedentes de ratones control ISG15+/+ e ISG15−/− presentan diferencias en diversos marcadores de fenotipo lo cual podría tener un papel relevante en la respuesta de la pared vascular a distintos estímulos. Más concretamente, la deficiencia de ISG15 se asocia a un aumento en la expresión de marcadores tanto contráctiles como de MEC (colágenos y fibronectina-1) así como una disminución del marcador del fenotipo calcificante Spp1, lo cual no parece afectar de manera importante, al menos aparentemente, al fenotipo de la arteria de un ratón control. Sin embargo, es posible que dichos cambios puedan predisponer al vaso a cambiar su estructura en diversas enfermedades (p.ej., AAA, aterosclerosis, hipertensión, restenosis) donde los cambios fenotípicos de las CML tengan un papel principal. Además, en ratones infundidos con Ang II, la pérdida del marcador de contractilidad Acta2 en ratones ISG15+/+ no se observa en ratones ISG15−/− y estos ratones también parecen tener menor expresión de marcadores como Spp1 o Col3. En muestras humanas encontramos que los niveles de expresión de ISG15 correlacionan negativamente con dos marcadores contráctiles, lo que sugiere que ISG15 podría tener un papel en la función contráctil de las CMLV que podría explicar las alteraciones en la contractilidad de las CMLV de pacientes con aneurisma33. También encontramos una correlación negativa entre ISG15 y COL3a1 indicando que ISG15 también podría contribuir a la pérdida de MEC que se produce en AAA avanzados. El análisis global de estos resultados sugiere que la eliminación de ISG15 podría favorecer un estado de protección vascular frente a los AAA, si bien son necesarios más estudios para confirmar completamente esta hipótesis. Es interesante mencionar que las muestras de los pacientes con AAA presentaron una disminución de la expresión del marcador contráctil CNN1, pero no de ACTA2, y del marcador de calcificación SPP1, aunque no de otros marcadores, comparados con pacientes sin AAA. Puesto que los pacientes sin AAA utilizados en este estudio ya presentan un importante daño vascular, no podemos descartar un papel de ISG15 en otras patologías vasculares. Asimismo, sería necesario aumentar el número de muestras humanas incluidas en el análisis, para profundizar más en el papel de ISG15 en el fenotipo vascular.
Los datos mostrados aquí y los publicados previamente30 muestran que la eliminación de ISG15 podría proteger del daño vascular. En este trabajo también demostramos, por primera vez, que la administración de ISG15 exógena ejerce cambios en la estructura de la pared y podría modular el fenotipo de las CMLV. Así, tras dicha administración se produce una tendencia a reducir el diámetro y grosor de la pared aórtica, asociada a aumentos en la expresión de marcadores de fenotipo a la dosis más baja estudiada, y claros efectos hipotróficos en arterias mesentéricas, posiblemente debidos a una disminución del número o del tamaño de las CMLV. No existen datos previos del papel de ISG15 libre en las CMLV. Sin embargo, se ha descrito que las CMLV pueden responder a IFNs de tipo 1, que inducirían estrés oxidativo y daño mitocondrial dando lugar a la transición al fenotipo senescente, en un proceso mediado por la vía cGAS-STING (sintasa de AMP-GMP cíclico-estimulador de genes de IFN), estrechamente relacionada con ISG1534–37. Una limitación de nuestro estudio es que no podemos saber si las concentraciones de ISG15 administradas se encuentran dentro del rango fisiopatológico observado en el ratón. Sin embargo, estos resultados nos permiten confirmar el efecto de ISG15 en la CML. Igualmente, nos invitan a estudiar su papel en aquellas situaciones patológicas en las que su expresión se encuentra aumentada.
Las alteraciones fenotípicas y estructurales producidas por ISG15 podrían tener un impacto funcional sobre la señalización mediada por distintos agonistas contráctiles, como se deduce de la mayor contractilidad observada con el análogo del tromboxano A2, U46619, aunque no de fenilefrina, que presentan las aortas de los ratones ISG15−/− comparados con sus controles. Por el contrario, y en consonancia con el remodelado vascular hipotrófico y la posible pérdida de CMLV, las arterias de ratones infundidas con ISG15r muestran disminución de contractilidad. Estos resultados añaden información a los publicados previamente sobre el papel de ISG15 en la función endotelial30 y apuntan a las CMLV como una diana adicional de ISG15 en el control del tono vascular.
ConclusionesNuestro trabajo muestra un posible papel de ISG15 como regulador del fenotipo de las CMLV, así como de la estructura y de la función vasculares. Nuestros resultados sugieren que el bloqueo de ISG15 podría evitar la transición de las CMLV de fenotipos sanos contráctiles a fenotipos patológicos, con efectos positivos asimismo en la contractilidad, la inflamación y el remodelado vascular.
FinanciaciónEste trabajo ha sido realizado gracias a la financiación obtenida a través de la Fundación Española de Arteriosclerosis (Beca FEA 2021-Investigación Básica). Además, el estudio ha contado con financiación MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por «ERDF A way of making Europe», PID2020-116498RB-I00, por las Redes de Investigación RED2022-134541-T financiada por MICIU/AEI/10.13039/501100011033 y por PI21/00084, del Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social.
Conflicto de interesesNinguno.
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