Antecedentes. La tiroglobulina es sintetizada exclusivamente en las células foliculares tiroideas, y su medición sérica se utiliza en el seguimiento del cáncer diferenciado de tiroides tratado. La presencia de autoanticuerpos antitiroglobulina (AcTG) en el paciente dificulta la detección exacta de tiroglobulina por métodos inmunoanalíticos.
Métodos. En este trabajo se evaluó el efecto de los AcTG, determinados por aglutinación de partículas (AGP) y por un método inmunométrico quimioluminiscente (IMQ), en la valoración de la tiroglobulina medida por dos técnicas de alta sensibilidad, pero basadas en distintos principios: inmunocompetencia (RIA) e inmunometría (quimioluminiscencia [QMO]). Se evaluó en el suero de 60 pacientes la tiroglobulina antes y después del agregado de una cantidad conocida de tiroglobulina, y se calculó el porcentaje de recuperación de la tiroglobulina agregada a cada suero.
Resultados. Los resultados mostraron que la presencia de AcTG, aun en bajas concentraciones detectadas por IMQ pero no por AGP, interfiere en la determinación de tiroglobulina, tanto por RIA como por QMO.
Conclusión. La determinación de tiroglobulina como marcador para el seguimiento del cáncer diferenciado de tiroides debe ir acompañada por la medición de AcTG por un método de alta sensibilidad. En caso de detectarse AcTG, aun en bajas concentraciones, la determinación de tiroglobulina debe ser considerada críticamente por la posibilidad de interferencia con los métodos de determinación.
INTRODUCCION
Los valores séricos de tiroglobulina, una proteína producida exclusivamente por células epiteliales del folículo tiroideo, tienen un valor importante en el diagnóstico y seguimiento de una variedad de alteraciones de la glándula tiroides1-6. La tiroglobulina es una yodoglicoproteína heterogénea de aproximadamente 660 kDa de peso molecular en la que se sintetizan y almacenan las hormonas tiroideas triyodotironina (T3) y tiroxina (T4). Fracciones pequeñas de tiroglobulina escapan normalmente a la circulación, pero existen condiciones en las que los valores plasmáticos de la proteína pueden aumentar considerablemente, tales como disrupción de la arquitectura integral del folículo tiroideo, ya sea por daño o inflamación del tiroides, por estimulación del receptor de TSH por autoanticuerpos en la enfermedad de Graves o por presencia de tejido tiroideo neoplásico diferenciado7.
La determinación de tiroglobulina circulante resulta de particular importancia para detectar la presencia de tejido neoplásico diferenciado residual o metastásico en pacientes afectados de cáncer diferenciado de tiroides y tratados por tiroidectomía o por radioablación, o ambos métodos combinados8-10. Actualmente la determinación de tiroglobulina se realiza por métodos inmunoanalíticos competitivos y no competitivos que difieren en el sistema de detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados y en su sensibilidad.
La tiroglobulina tiene una gran capacidad inmunogénica que favorece la aparición de autoanticuerpos (AcTG) en sujetos proclives11,12. La presencia de estos autoanticuerpos provoca errores en la determinación de tiroglobulina por métodos inmunoanalíticos, ya que compiten por la unión al antígeno con los anticuerpos utilizados en los ensayos y pueden aumentar o disminuir el valor real de la tiroglobulina circulante6,13,14.
En este trabajo se planteó determinar si la presencia de AcTG endógenos, aun en bajas concentraciones, influía en la determinación de tiroglobulina realizada mediante dos inmunoanálisis basados en distintos sistemas de detección, radiactivo (RIA) y enzimoquimioluminimétrico (QMO), y en distintos métodos, competitivo y no competitivo, respectivamente. Los resultados indican que la presencia de cantidades bajas de AcTG endógenos, sólo detectables por técnicas de alta sensibilidad, afecta a ambos inmunoanálisis.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con el suero de 60 pacientes que acudieron al Instituto de Patología Tiroidea de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo y a un laboratorio de análisis clínicos privado, entre febrero y agosto de 1998. Las edades de los pacientes se incluyeron en los límites de 10-68 años, siendo 49 mujeres y 11 varones. Dado el planteamiento del trabajo, se seleccionó a pacientes asociados a enfermedad de Graves-Basedow (n = 8) y a tiroiditis de Hashimoto (n = 15), en tratamiento o recién detectados y sin tratamiento. Se incluyó a 26 pacientes afectados por cáncer diferenciado de tiroides, tratados por cirugía y en seguimiento. Los pacientes fueron ambulatorios y aquellos en seguimiento por cáncer diferenciado de tiroides se encontraban sin medicación tiroidea sustitutiva. También se seleccionaron sujetos eutiroideos (n = 11).
Los especímenes de sangre fueron recolectados con más de 3 horas de ayuno, sin anticoagulantes y asépticamente por venepunción. Tras 30 min a temperatura ambiente, se centrifugaron a 2.000 * g y los sobrenadantes, libres de hemólisis, se conservaron congelados a 20 °C. Todos los sueros se procesaron por duplicado y en conjunto, utilizando los mismos lotes de reactivos.
Técnicas de determinación de anticuerpos antitiroglobulina
La determinación de los AcTG se realizó por dos técnicas: a) aglutinación de partículas (AGP) (SERODIA®-ATG, Fujirebio Inc., Tokyo, Japón), de uso asistencial corriente y que considera negativos a títulos por debajo de la dilución 1/100, y b) inmunométrico de fase sólida quimioluminiscente automatizado (IMQ) (IMMULITE® Anti-TG Ab, Diagnostic Products Corporations, Los Ángeles, EE.UU.), que considera como valor de referencia normal por debajo de 40 Ul/ml. Este ensayo está estandarizado según OMS (1st IRP 65/93) y tiene un valor mínimo medible de 20 Ul/ml sin dilución del suero. La precisión intraensayo del equipo utilizado fue del 2,3 y el 2,7% para valores de 66 y 548 Ul/ml, respectivamente. La precisión interensayo fue del 8,1 y el 9,1% para valores de 101 y 1.197 Ul/ml, respectivamente.
Técnicas de determinación de tiroglobulina
La determinación de tiroglobulina se realizó por dos métodos de distinto principio: a) inmunocompetencia por RIA, con anticuerpos policlonales (Double Antibody Thyroglobulin, Diagnostic Products Corporations, Los Ángeles, EE.UU.), con un límite de detección menor de 2,6 ng/ml. La precisión intraensayo para el equipo utilizado fue del 5,7 y el 3,2% para valores de 5,4 y 112 ng/ml, respectivamente. La precisión interensayo fue del 8,7 y el 4,5% para valores de 5,5 y 119 ng/ml, respectivamente, y b) inmunométrico no competitivo quimioluminiscente automatizado, con anticuerpos monoclonales antitiroglobulina en fase sólida y anticuerpos policlonales antitiroglobulina conjugados con fosfatasa alcalina (IMMULITE® Thyroglobulin, Diagnostic Products Corporations, Los Ángeles, EE.UU.), con un límite de detección menor de 0,2 ng/ml. La precisión intraensayo del equipo utilizado fue del 5,7 y el 5,4% para valores de 21 y 122 ng/ml, respectivamente. La precisión interensayo fue del 7 y el 7,7% para valores de 2 y 116 ng/ml, respectivamente.
Las mediciones de quimioluminiscencia fueron realizadas en un sistema analizador automático de inmunoensayo quimioluminiscente, IMMULITE® (Diagnostic Products Corporations, Los Ángeles, EE.UU.).
Estudios de recuperación de tiroglobulina agregada
A fin de estudiar directamente la interferencia in vitro entre AcTG y la medición de tiroglobulina, se midió en cada uno de los sueros la tiroglobulina endógena y luego se agregó una cantidad aproximada de 10 ng/ml de tiroglobulina. Para ello se utilizaron los calibradores provistos correspondientes a cada técnica. Se trabajó con una mezcla de 9 partes del suero más una parte del calibrador. Los calibradores consisten en una combinación de sueros con AcTG no detectables y una concentración de TG aproximada de 100 ng/ml. La mezcla se preincubó durante 2 h a temperatura ambiente antes del ensayo, y se volvió a medir la tiroglobulina resultante. En función del valor obtenido antes y después del agregado de tiroglobulina, se calculó el porcentaje de recuperación (%R) de tiroglobulina (TG) para cada técnica y para cada suero. El %RRIA se calculó como:
%RRIA = (TGRIA [endógena + agregada]/[TGRIA endógena + TG teórica agregada]) * 100
Para %RQMO el cálculo fue equivalente utilizando las mediciones correspondientes a esta metodología. El análisis de regresión y la comparación de medias por ANOVA fueron realizados con el programa KyPlot (K. Yoshioka).
RESULTADOS
Comparación entre métodos de medición de AcTG
Ambos métodos utilizados evidenciaron una buena correlación en la estimación de la presencia de AcTG. Sin embargo, varios sueros con valores de AcTG inferiores a 60 Ul/ml, medidos por IMQ, resultaron negativos por AGP (fig. 1). Estas discrepancias eran de esperar, dada la mayor sensibilidad de IMQ. Excluyendo estos sueros, el coeficiente de correlación entre ambos métodos fue muy elevado, indicando un alto grado de concordancia entre los mismos (fig. 1). Esto queda claramente reflejado en el análisis de residuales donde se observa que existió una buena coincidencia (residuales pequeños) entre los métodos en los sueros sin AcTG detectables por IMQ y en los métodos con valores superiores a 60 Ul/ml (fig. 1B). Se produjo, en cambio, una marcada discrepancia en sueros con valores de AcTG inferiores a 60 Ul/ml. Hubo, curiosamente, un suero con reactividad por AGP a la dilución 1/100 que fue negativo por IMQ, que se observa apartado de la regresión en la figura 1A y con un elevado residual en la figura 1B. Dada la mayor sensibilidad para la detección de AcTG por IMQ, los sueros se clasificaron de acuerdo con el valor de anticuerpos medido por esta técnica en: AcTG no detectables, AcTG inferiores a 60 Ul/ml y AcTG superiores a 60 Ul/ml.
Medición de tiroglobulina circulante por RIA y QMO en presencia de AcTG
Los valores de tiroglobulina medidos por dos métodos de alta sensibilidad pero que difieren en sus principios, uno inmunocompetitivo y otro no competitivo inmunométrico, tuvieron una correlación aceptable cuando se evaluó en sueros con AcTG no detectables (fig. 2). La correlación no fue tan buena cuando se consideraron los sueros con AcTG. En estos sueros se observa una marcada tendencia a tener valores por RIA mayores que por QMO, sobre todo para valores de tiroglobulina menores a 10 ng/ml (fig. 1A). El análisis de residuales puso de manifiesto que en sueros con concentraciones medibles de AcTG los residuales son mayormente positivos, señalando que en estos sueros el método competitivo (RIA) proporciona valores mayores que el no competitivo (QMO) (fig. 2B). Es notable, sin embargo, que los residuales no evidenciaron una tendencia definida en función de la cantidad de AcTG presente en los sueros. Incluso los sueros con bajas concentraciones de AcTG (inferiores a 60 Ul/ml) evidenciaron residuales positivos, sugiriendo que la presencia de pequeñas cantidades de AcTG pueden alterar la medición de tiroglobulina por los métodos analizados (fig. 2B).
Efecto de la presencia de AcTG en recuperación por RIA y QMO
A fin de determinar el efecto de AcTG en la medición de tiroglobulina, se calculó el porcentaje de recuperación en función de las cantidades medidas de tiroglobulina antes y después de la adición de una cantidad fija de esta proteína.
Notamos en dos casos que los valores de RIA, al medirse por segunda vez con el agregado de la tiroglobulina para el cálculo de la recuperación, evidenciaron valores excesivamente elevados y discordantes absolutamente con el valor de tiroglobulina esperable. Ambos sueros eran lipémicos y con altos valores de triglicéridos (> 400 mg/dl). Estos dos casos no fueron considerados en el análisis de la recuperación. Estos mismos sueros no presentaron interferencias en la medición de tiroglobulina por QMO.
En los sueros con AcTG no detectables, la recuperación promedio por ambos métodos fue próxima al 100% (99% ± 3% [media ± error estándar] para RIA y 103% ± 5% para QMO; fig. 3, panel izquierdo). Sin embargo, en sueros con valores de anticuerpos superiores a 60 Ul/ml, las recuperaciones bajaron al 65% ± 9% para RIA y al 53% ± 5% para QMO (valores significativamente menores, p < 0,01) (fig. 3, panel derecho). Las recuperaciones fueron significativamente menores aun en los sueros con concentraciones bajas de AcTG (menores de 60 Ul/ml) (68% ± 9% para RIA y 64% ± 7% para QMO; p < 0,01) (fig. 3, panel central).
Las recuperaciones en presencia de AcTG fueron significativamente mayores utilizando RIA que QMO (p < 0,05). Sin embargo, este método no parece estar menos afectado que QMO por la presencia de AcTG. Hubo dos casos en los que se observaron valores de tiroglobulina medidos por RIA en pacientes con cáncer diferenciado de tiroides tratados con tiroidectomía total sin evidencia de persistencia o recurrencia de la enfermedad, sugiriendo que el método estaba siendo afectado por la presencia de autoanticuerpos en estas muestras. Sin embargo, en los sueros de estos 2 pacientes se mostraron recuperaciones normales por RIA.
DISCUSIÓN
La determinación de tiroglobulina sérica se utiliza fundamentalmente en el seguimiento de pacientes con cáncer diferenciado de tiroides tratados por cirugía o ablación radioisotópica1,6. La determinación de tiroglobulina se realiza bianualmente, una vez en concordancia con una centellografía con yodo radiactivo y la otra como evaluación única y con medicación supresora15. Este seguimiento pretende poner de manifiesto la aparición de tejido tiroideo metastásico o la presencia del tejido tiroideo remanente8.
La tiroglobulina se evalúa corrientemente mediante diversos inmunoensayos que pueden diferir en el método (competitivos y no competitivos), la detección de la señal del inmunoanálisis y en su sensibilidad, pero todos utilizan anticuerpos específicos, monoclonales o policlonales, que reconocen tiroglobulina16-19. Los competitivos se basan en la competencia de la tiroglobulina presente en la muestra y de la tiroglobulina marcada del ensayo por una cantidad limitada de AcTG. Los inmunométricos o no competitivos se basan, en cambio, en la determinación de la cantidad de un anticuerpo marcado que se une a la tiroglobulina de la muestra inmovilizada por un primer anticuerpo fijado a una fase sólida. En consecuencia, es lógico que la presencia de AcTG endógenos en el suero de los pacientes afecte la determinación de tiroglobulina por inmunoensayos.
La presencia de AcTG en el suero de los pacientes es algo frecuente y diversas teorías hablan sobre las causas de la autoinmunidad tiroidea20-23. El efecto de los AcTG sobre la valoración de TG depende de los inmunoensayos, siendo frecuente que provoquen subestimaciones en los no competitivos inmunométricos (al complejarse con la tiroglobulina endógena e interferir con su unión al anticuerpo inmovilizado o al marcado) y sobre o subestimaciones en los métodos competitivos (al complejarse con la tiroglobulina endógena y la marcada, alterando el equilibrio de los complejos formados y su precipitación por el segundo anticuerpo). Varios autores han investigado las interferencias de sueros con AcTG endógenos sobre distintas metodologías inmunoanalíticas con resultados diversos5,18,24,25. En este trabajo se han analizado dos técnicas inmunoanalíticas, una competitiva y otra no competitiva, comparables en su sensibilidad. En concordancia con lo esperado, los resultados obtenidos midiendo la tiroglobulina circulante indican que la presencia de AcTG afecta la determinación de esta proteína, provocando un aumento de los valores medidos por el método competitivo respecto de los obtenidos por el no competitivo. Resultó sorprendente no encontrar una relación directa entre la cantidad de AcTG en el suero y el grado de alteración de las mediciones, observándose interferencia incluso en sueros con bajas concentraciones de AcTG. Esta conclusión fue corroborada directamente midiendo la recuperación de tiroglobulina adicionada a las muestras. En estos ensayos se observó una marcada interferencia en el porcentaje de recuperación por la presencia de bajas concentraciones de AcTG. La escasa relación entre la concentración de AcTG y la interferencia con las mediciones de tiroglobulina indica que es importante no sólo la cantidad de AcTG en las muestras sino también las características de los autoanticuerpos presentes. La afinidad por tiroglobulina y el epítopo reconocido por los anticuerpos endógenos son probablemente críticos para determinar su capacidad para afectar a los inmunoensayos.
El análisis de recuperación mostró que RIA tuvo en general valores mayores que QMO. Esta observación podría indicar que el método competitivo utilizado se ve menos afectado por la presencia de AcTG, o que existe una compensación de errores entre las mediciones antes y después del agregado de tiroglobulina. Esta última interpretación está más de acuerdo con la incongruencia planteada entre los valores de tiroglobulina determinados por RIA y el estado clínico de dos pacientes, a pesar de que en los mismos se detectaron recuperaciones normales. De todos modos, también los valores de recuperación por RIA fueron significativamente alterados en sueros con AcTG, indicando claramente que el método es afectado por los autoanticuerpos.
En conclusión, al igual que otros autores19,26-30, encontramos que la presencia de AcTG endógenos es un factor de error importante en la cuantificación de tiroglobulina por métodos inmunoanalíticos. En total concordancia con el reciente trabajo de Spencer et al19, observamos que incluso bajas concentraciones de AcTG son suficientes para afectar significativamente la determinación de tiroglobulina. Otras metodologías para la determinación de AcTG de menor sensibilidad, como AGP, pueden ser adecuadas para la valoración de autoanticuerpos en el diagnóstico de enfermedades de autoinmunidad pero no para el seguimiento del cáncer diferenciado de tiroides. Ante sueros con presencia de AcTG, la determinación de tiroglobulina debe ser considerada críticamente por la posibilidad de interferencia con los métodos de determinación.
La detección de células productoras de tiroglobulina en pacientes con autoanticuerpos se encamina a métodos que no estén afectados por la presencia de AcTG. Por ello, se han generado equipos de valoración de tiroglobulina que utilizan una selección de anticuerpos monoclonales que no coinciden con los epítopos reconocidos por los autoanticuerpos25. Otra posibilidad es la determinación en suero de ARN mensajero para tiroglobulina por biología molecular31,32.
AGRADECIMIENTO
Este trabajo se realizó mediante subvenciones del Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Cuyo. Se agradece al Dr. K. Yoshioka por permitirnos el uso de su excelente programa KyPlot.