Todas las actividades demostraron una distribución heterogénea. Los niveles más altos se observaron para las alanil- y arginil aminopeptidasas solubles y ligadas a membranas y los más bajos para las glutamil y aspartil aminopeptidasas.
Las actividades de alanil y arginil aminopeptidasas presentaron su mayor concentración en el cerebro en su forma soluble. Sin embargo, en su forma ligada a membrana su mayor concentración se observó en el riñón.
La cistinil-aminopeptidasa mostró mayor actividad en el riñón en su forma soluble y ligada a membranas. La piroglutamil-aminopeptidasa soluble presentó su nivel más alto en el hígado y el riñón, y la forma ligada a membrana en el hígado. Finalmente, la angiotensina A presentó su mayor actividad en el riñón.
Las alanil-, arginil-, cistinil- y piroglutamil-aminopeptidasas solubles incrementaron significativamente sus actividades en las suprarrenales y la neurohipófisis. En el riñón las alanil-, arginil- y glutamil-aminopeptidasas ligadas a membrana disminuyeron significativamente en animales de masa renal baja.
Estos resultados sugieren la participación de actividades de estas aminopeptidasas en la patogenia de la hipertensión de masa renal baja.
All the activities demonstrated an heterogeneous distribution. The highest levels were observed for soluble and membrane bound alanyl- and arginyl-aminopeptidase in all tissues, and the lowest for glutamyl- and aspartyl-aminopeptidase.
Alanyl- and arginyl-aminopeptidase activities exhibited their highest levels in brain in its soluble form. However, in their membrane bound form their highest levels were observed in kidney. Cystinyl-aminopeptidase demonstrated its highest activity in kidney in its soluble and membrane bound forms. Soluble pyroglutamyl-aminopeptidase exhibited its highest level in liver and kidney, and the membrane-bound form in liver. Finally, angiotensinase A demonstrated its highest level of activity in kidney.
Soluble alanyl-, arginyl-, cystinyl-, and pyroglutamyl-aminopeptidase increased significantly their activities in adrenal and neurohypophysis. In kidney, membrane bound alanyl-, arginyl- and glutamyl-aminopeptidase decreased significantly in low renal mass animals.
These results suggest the involvement of aminopeptidase activities in the pathogenesis of low renal mass hypertension
Las aminopeptidasas (AP) constituyen un grupo de enzimas proteolíticas caracterizadas por su capacidad para hidrolizar aminoácidos cercanos al extremo aminoterminal de péptidos, polipéptidos y sustratos artificiales1. Consecuencia de su actividad puede ser la inactivación del péptido en cuestión o un cambio en la actividad biológica del mismo. Por tanto, estas enzimas, que se encuentran distribuidas ubicuamente en tejidos y fluidos corporales, pueden cumplir funciones reguladoras o moduladoras sobre distintos péptidos.
La actividad AP interviene en la regulación del sistema renina-angiotensina (SRA)2,3 actuando sobre la angiotensina II (Ang II), mediante la actividad hidrolítica de glutamato y aspartato-AP (A) que libera el aspártico aminoterminal, dando lugar a la angiotensina III (Ang III). Este péptido, a su vez, puede ser hidrolizado por la actividad AP B y M (arginina y alanina-AP) que separa la arginina aminoterminal y rinde angiotensina IV (Ang IV). La Ang II va a actuar regulando la resistencia vascular y el volumen de flujo sanguíneo tanto a nivel endocrino como paracrino y autocrino, ya que se han descrito diversos SRA locales4, siendo un factor clave en la patogenia de la hipertensión.
Dentro de este contexto, se han descrito modificaciones en las concentraciones de AP séricas en modelos de hipertensión genética5. También se ha demostrado que la inyección intracerebroventricular de AP (A, B y M) y de sus inhibidores produce, respectivamente, una elevación y disminución de la presión sanguínea, tanto en ratas genéticamente hipertensas como en sus controles normotensos6,7. Estos resultados han demostrado una relación directa entre la actividad AP y la hipertensión arterial. Sin embargo, pocos trabajos han estudiado la actividad AP en modelos de hipertensión distintos al genético.
Además de las descritas, otras actividades AP pueden estar también implicadas en el control del mantenimiento de la presión arterial, tal es el caso de la cistina-AP, con capacidad para hidrolizar in vitro a la vasopresina8, aunque en la actualidad su papel fisiológico no está bien definido.
El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la distribución tisular y la posible participación de distintas actividades AP en un modelo animal de hipertensión de baja renina: animales con masa renal reducida (MRR), en los que estas actividades enzimáticas podrían desempeñar un importante papel en la regulación de las posibles modificaciones de los SRA locales, así como en el control de péptidos activos distintos al SRA circulante (p. ej., vasopresina y endotelinas), cuya función en este modelo se encontraría disminuida9.
Con este fin, se midió la capacidad arilamidasa de seis actividades AP: alanina-AP (EC 3.4.11.14; AlaAP), arginina-AP (EC 4.3.11.6; ArgAP), cistina-AP (EC 3.4.11.3; CysAP), piroglutamato-AP (EC 3.4.11.8; pGluAP), glutamato-AP (EC 3.4.11.7; GluAP) y aspartato-AP (EC 3.4.11.-; AspAP), en el suero y en la fracción soluble y unida a la membrana de distintos tejidos procedentes de ratas control y ratas a las que se les indujo un modelo de hipertensión con MRR.
MATERIAL Y MÉTODOS
Un lote de ratas macho Wistar con pesos comprendidos entre los 180 y los 200 g fue dividido al azar en dos grupos experimentales: ratas control y ratas hipertensas. La hipertensión del modelo de baja renina (MRR) se indujo por nefrectomía parcial bajo anestesia con éter. Paralelamente, los animales control fueron sometidos a una operación quirúrgica fingida sin incluir la nefrectomía. Una semana después de dicha operación, el agua de bebida fue sustituida en ambos grupos de animales por una solución de cloruro sódico al 1%. La presión sanguínea sistólica de todos los animales se midió semanalmente mediante pletismografía. Cuatro semanas después del proceso quirúrgico, la presión media del grupo de ratas nefrectomizadas fue de 161,3 ± 3,1 mmHg frente a 132,0 ± 2,5 mmHg en las ratas control.
Transcurridas 4 semanas de la cirugía, los animales fueron anestesiados (Equitensín, 2 ml/kg de peso vivo) y se procedió a la extracción de una muestra de sangre por punción en el ventrículo izquierdo. Posteriormente, se perfundió a los animales con solución salina (ClNa al 0,9%) a través del ventrículo izquierdo y se obtuvieron muestras del riñón, las glándulas suprarrenales, el hígado, el ventrículo, la retina, la corteza cerebral frontal, el hipotálamo, la hipófisis anterior y la hipófisis posterior. Cada una de las muestras fue rápidamente congelada y mantenida a ­80 °C hasta su utilización. Con el fin de obtener la fracción soluble y unida a la membrana, cada muestra de tejido fue homogeneizada en tampón Tris-ClH 10 mM, pH 7,4, y ultracentrifugada a 100.000 g durante 30 min a 4 °C. Los sobrenadantes resultantes fueron utilizados para medir las actividades enzimáticas y el contenido en proteínas de la fracción soluble. Los sedimentos de la primera ultracentrifugación fueron resuspendidos en tampón Tris-ClH 10 mM, pH 7,4, con Tritón X-100 al 1% con el fin de solubilizar las proteínas de membrana. Posteriormente, se ultracentrifugaron y el sobrenadante se utilizó para medir las actividades enzimáticas y el contenido en proteínas de la fracción unida a la membrana, después de retirar el detergente mediante el uso del absorbente polimérico Bio-Bead SM-2 (100 mg/ml), para evitar su interferencia en las determinaciones enzimáticas10.
Las actividades AlaAP, ArgAP y CysAP fueron medidas fluorimétricamente utilizando como sustratos alanil-2-naftilamida (AlaNNap), arginil-2-naftilamida (ArgNNap) y cistinil-2-naftilamida (CysNNap), de acuerdo con el método modificado de Greenberg11. La actividad pGluAP fue medida fluorimétricamente utilizando como sustrato pGluNNap, de acuerdo con el método modificado de Schwabe y McDonald12. La actividad GluAP fue determinada fluorimétricamente utilizando como sustrato GluNNap, de acuerdo con el método de Tobe et al13. La actividad de AspAP fue determinada fluorimétricamente utilizando como sustrato AspNNap según el método modificado de Cheung y Cushman14.
Las proteínas se cuantificaron por el método de Bradford15 utilizando como estándar BSA. Las actividades AP específicas, tanto solubles como unidas a la membrana, se expresaron como nmol de AlaNNap, ArgNNap o CysNNap hidrolizados por minuto y por mg de proteína, y como pmol de pGluNNap, GluNNap o AspNNap hidrolizados por minuto y por mg de proteína. En todos los casos, la fluorescencia fue lineal respecto al tiempo de hidrólisis y a la concentración de proteína.
Las comparaciones de los valores de la presión arterial entre animales normotensos e hipertensos se llevaron a cabo utilizando un ANOVA II (modelo animal y edad). El análisis de las concentraciones de proteína en el suero, así como el de la distribución tisular de la actividad AP, se realizó mediante un ANOVA I. Para las comparaciones posteriores de medias se utilizó el test de Bonferroni. Todos los valores de p < 0,05 fueron considerados como significativos.
RESULTADOS
En la figura 1, se indican los valores medios ± los errores estándar de presión arterial obtenidos en los dos grupos experimentales desde la operación quirúrgica hasta el momento del sacrificio.
Desde la primera semana, se puede observar un incremento significativo en las ratas nefrectomizadas respecto a las control (p < 0,001 para la primera, tercera y cuarta semanas; p < 0,01 para la segunda semana). El análisis también revela que a lo largo del tiempo no aparecen diferencias en los valores de la presión arterial de los animales nefrectomizados; sin embargo, en los animales control sí se demuestra un incremento significativo entre los valores de la presión arterial correspondientes a la primera y tercera semanas postoperatorias (p < 0,01).
Los valores medios ± los errores estándar de la concentración de proteínas en el suero de animales control e hipertensos, expresados en mg de proteína contenidos en 1 ml de suero, fueron respectivamente de 632 ± 12 frente a 555 ± 29, y se detectó una disminución significativa (p < 0,05) del contenido de proteínas en los animales MRR.
En las figuras 2-4, se exponen las distribuciones tisulares de cada una de las actividades AP estudiadas. En cada gráfica aparecen los valores medios ± los errores estándar para los animales control e hipertensos, expresados como nmol de AlaNNap, ArgNNap y CysNNap o como pmol de pGluNNap, GluNNap y AspNNap hidrolizados por minuto y por mg de proteína.
Las actividades de AlaAP y ArgAP demuestran un patrón muy similar de distribución tisular tanto en animales normotensos como hipertensos (fig. 2). En ambos casos, los mayores niveles de actividad soluble se observan a nivel cerebral (corteza e hipotálamo) y los menores en el suero. La actividad unida a la membrana demuestra sus mayores niveles en el riñón y los menores en la hipófisis posterior, la retina y el ventrículo. También entre ambas actividades unidas a la membrana, tan sólo se encuentra una diferencia referida a la actividad marcadamente superior de la AlaAP en el hígado. Cuando se compara el perfil de distribución regional de la actividad soluble con el de la unida a la membrana, se puede constatar que ambos difieren marcadamente. En lo referente al efecto de la hipertensión, en la figura 2 se observa que las actividades de AlaAP y ArgAP soluble se incrementan en la hipófisis posterior (p < 0,01) y las glándulas suprarrenales (p < 0,01) de los animales hipertensos respecto a los normotensos, mientras que las actividades unidas a la membrana descienden (p < 0,01) en el riñón de este mismo grupo de animales.
El patrón de distribución tisular obtenido para la actividad CysAP es distinto al obtenido para AlaAP y ArgAP (fig. 3). Al igual que ocurría en las actividades anteriores, la CysAP soluble y la unida a la membrana presentan un patrón de distribución tisular diferente. Para la actividad soluble, las mayores concentraciones se encuentran a nivel renal y las menores en el ventrículo. Las concentraciones séricas de esta actividad son prácticamente indetectables. En la actividad unida a la membrana, los valores más altos se encuentran también en el riñón, pero la actividad, en la mayor parte del resto de los tejidos analizados, fue muy escasa. Por otro lado, la actividad soluble demuestra un incremento significativo (p < 0,01) en la hipófisis posterior y en la glándula suprarrenal de las ratas hipertensas respecto a las normotensas. En el resto de los casos, no se detectan diferencias significativas entre los dos grupos experimentales.
Para la actividad pGluAP, también se encuentran diferencias en la distribución tisular de las fracciones soluble y unida a la membrana (fig. 3). Los mayores valores de actividad soluble se detectan en el hígado y el riñón, y los menores en la hipófisis, llegando a ser indetectables en el suero. Para la actividad unida a la membrana, los valores más altos se corresponden con los hepáticos, sin que el resto demuestre diferencias entre sí. En lo que se refiere al efecto de la hipertensión, la actividad de pGluAP soluble se ve incrementada en la hipófisis posterior (p < 0,001), la hipófisis anterior (p < 0,05) y la glándula suprarrenal (p < 0,001).
Como se observa en la figura 4, resulta muy llamativa la alta actividad de GluAP detectada a nivel renal, donde la actividad soluble es 10 veces superior a la del resto de tejidos, y la unida a la membrana llega a multiplicar por 100 los valores detectados en otras localizaciones. Por el contrario, la actividad GluAP en el suero, la hipófisis posterior y el ventrículo es indetectable. La actividad AspAP demuestra un patrón de distribución muy similar en las fracciones soluble y unida a la membrana (fig. 4). Aunque los mayores valores corresponden al riñón, éstos son marcadamente inferiores a los obtenidos para la GluAP; en contrapartida, la actividad de AspAP sí es detectable en el suero. En lo referente al efecto de la hipertensión, se obtiene un incremento significativo (p < 0,05) en la actividad AspAP unida a la membrana en la hipófisis posterior y la retina de los animales hipertensos, incremento que también se observa en la retina para la GluAP, aunque no alcanza valores estadísticamente significativos. Para la GluAP, se encuentran cambios significativos (p < 0,05) en la fracción unida a la membrana renal, si bien en este caso se trata de un descenso.
DISCUSION
Los valores de la presión arterial demuestran que la hipertensión en los animales MRR se instaura muy pronto tras el momento de la operación. Los cambios a lo largo del tiempo en el grupo control probablemente se deban a la ingesta de sal, pero en ningún caso son suficientes para considerar a este grupo de animales como hipertensos. Por otro lado, la disminución en el contenido en proteínas séricas confirma que en este modelo de baja renina la hipertensión es debida, al menos en parte, a una hipervolemia.
La similitud en los patrones de distribución de la AlaAP y la ArgAP podría indicar sustratos comunes para estas actividades. La diferencia en los perfiles de distribución regional de las actividades solubles y unidas a la membrana indicaría la existencia de enzimas diferentes con propiedades y funciones distintas. Las actividades ArgAP (AP B) y AlaAP (AP M) se han relacionado con la regulación del SRA, por tanto, con la hipertensión, ya que son capaces de actuar hidrolizando la Ang III para dar lugar a la Ang IV, que también posee actividad biológica16. En el presente estudio, no se detectan variaciones significativas en las concentraciones de AP M en el suero, previamente descritas en la bibliografía para animales genéticamente hipertensos en los que el SRA circulante es hiperactivo2; por tanto, nuestros resultados están en consonancia con el hecho de que, en el modelo de hipertensión estudiado, dicho sistema se encuentra hipoactivo9. Sin embargo, encontramos diferencias en los valores de actividad en la hipófisis posterior y las glándulas suprarrenales. En la glándula suprarrenal, se ha descrito un SRA local que incluiría también las actividades angiotensinasas4, y también se ha propuesto la existencia de un sistema local en la neurohipófisis17,18. Los cambios simultáneos de las actividades AlaAP y ArgAP en estas localizaciones podrían indicarnos una variación paralela en los sistemas locales en este modelo de hipertensión. Estos resultados están de acuerdo con datos previos que demuestran que el SRA de las glándulas suprarrenales no se ve afectado bajo situaciones patológicas que hacen descender las concentraciones plasmáticas de renina19,20. Por último, el descenso en las concentraciones de AlaAP y ArgAP en el riñón de los animales hipertensos estaría en concordancia con las reducidas cantidades de Ang III que presenta este modelo2.
La actividad CysAP se ha relacionado con uno de los péptidos implicados en el control de la presión arterial, la vasopresina, ya que se ha podido demostrar que esta actividad enzimática es capaz de llevar a cabo la hidrólisis in vitro de dicho péptido8. En el modelo de hipertensión de baja renina utilizado en el presente estudio, se ha descrito un incremento en las concentraciones de vasopresina9. También se ha demostrado la existencia de receptores para esta hormona en la médula y la corteza suprarrenal21, así como un papel estimulador de la secreción de aldosterona y corticosterona21. Estos datos estarían de acuerdo con el incremento en los valores de actividad CysAP soluble en la hipófisis posterior y la glándula suprarrenal de las ratas hipertensas, resultados que refuerzan el posible papel de la vasopresina en la patogenia de este modelo de hipertensión.
La actividad pGluAP en su forma soluble se ha implicado en la hidrólisis de la TRH y la LH-RH1, así como en la degradación de la neurotensina y la bombesina22. En el presente estudio, encontramos incrementos significativos en los valores de actividad soluble de pGluAP, tanto en la hipófisis anterior cómo en la glándula suprarrenal de las ratas hipertensas, lo que podría ser indicativo de un papel de esta actividad enzimática y de sus sustratos en una posible respuesta coordinada hipotálamo-hipófisis-suprarrenales en el modelo de hipertensión de baja renina.
También nos parece interesante resaltar el paralelismo encontrado en las variaciones debidas a la hipertensión entre la hipófisis posterior y la glándula suprarrenal para algunas de las actividades determinadas (AlaAP, ArgAP, CysAP y pGluAP). Estos resultados indican una respuesta coordinada de ambas glándulas ante las variaciones inducidas en los animales nefrectomizados.
Tanto la GluAP como la AspAP (actividad AP A) presentan capacidad para hidrolizar aminoácidos dicarboxílicos de péptidos y polipéptidos, si bien la primera de ellas tiene preferencia por los restos glutamilos y la segunda por los aspartilos. Ambas parecen ser actividades fundamentalmente unidas a la membrana y muy abundantes en el riñón. El descenso de actividad GluAP unida a la membrana a nivel renal en los animales con MRR indica un papel en la patogenia de este modelo de hipertensión. La actividad AP A o angiotensinasa participa en el paso de Ang II a Ang III16 y el descenso de esta actividad en el riñón correría paralelo a las bajas concentraciones generales de Ang II, pudiendo estar encaminado a prolongar la acción de dicho péptido.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio ha sido financiado por la DGICYT a través del proyecto PB92-0454.