La sepsis en recién nacidos hospitalizados en la unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN) constituye un problema mundial que contribuye significativa-mente a la morbilidad y mortalidad1-4. La mayor parte de los estudios prestan atención a los lactantes de peso muy bajo al nacer (PMBN) dado su sistema inmunitario inmaduro y la contribución añadida de una diversidad de factores de riesgo1,5,6. Es importante comprender que los lactantes prematuros incluso tardíos presentan un compromiso del sistema inmunitario y son vulnerables a las infecciones en la UCIN7,8.
El reconocimiento y el diagnóstico precoces de la sepsis neonatal son difíciles porque la presentación clínica de este proceso es variable e inespecífica. Es muy importante establecer un diagnóstico precoz de sepsis porque la instauración inmediata de un tratamiento antimicrobiano mejorará el pronóstico. El aislamiento de las bacterias de un líquido corporal central (habitualmente, la sangre) es el método de referencia y más específico para su diagnóstico1,9,10. Se ha revelado que se produce bacteriemia en un 32,3% de infecciones con tasas de mortalidad que fluctúan del 15 al 50%11. En estudios de publicación reciente se ha documentado que en la mayoría de las circunstancias, si los hemocultivos no son positivos a las 48 h, puede interrumpirse el tratamiento empírico con antibióticos10,12-14.
En esta población vulnerable persiste el problema de la exposición innecesaria a los antibióticos, creando un medio para la emergencia de resistencia bacteriana y la posibilidad de un mal pronóstico15. De modo no sorprendente, se han hecho tentativas para usar parámetros fisiológicos16-18, índices hematológicos10,18-20 y los perfiles de las citocinas10,11,19,21-23 en el momento del inicio del episodio sospechado de sepsis con el objetivo de identificar con precisión al recién nacido con el proceso. Recientemente, se ha revisado el papel de las citocinas como ayuda diagnóstica en la sepsis neonatal24,25. A pesar del hecho de que la mayoría de las citocinas como marcadores se caracterizan por valores predictivos negativos elevados24 (es decir, son apropiadas para descartar la sepsis), no se han adaptado para un uso médico general. En parte, esto se debe a las mayores cantidades de sangre necesarias, el intervalo prolongado que transcurre hasta obtener los resultados (en particular, si se usan técnicas ELISA) y los costes implicados. Al mismo tiempo, el hemograma con la fórmula leucocitaria, rápidamente disponible, se caracteriza por una baja especificidad para el diagnóstico de sepsis. La asociación del recuento de bandas y la desviación a la izquierda de la inmadurez de la serie mieloide mejora el rendimiento diagnóstico pero su determinación subjetiva es problemática. Por lo tanto, persiste la necesidad de mejorar los indicadores diagnósticos de la sepsis neonatal.
Recientemente, se ha prestado atención a los antígenos de superficie de la célula leucocitaria como marcadores diagnósticos de la sepsis26. El antígeno CD64 de la superficie de neutrófilos, el receptor Fc de alta afinidad, es regulado cuantitativamente al alza durante la infección y la sepsis bajo la influencia de las citocinas inflamatorias. Este aumento de la densidad de superficie se produce de una manera escalonada en función de la intensidad del estímulo de las citocinas y de si la expresión de CD64 es estable durante más de 24 h27. Los progresos tecnológicos en flujocitometría han hecho posible cuantificar rápidamente con precisión el antígeno CD64 expresado en los neutrófilos y, lo que es más importante en el caso de los recién nacidos, con el uso de volúmenes mínimos de sangre26, pero la expresión de CD64 todavía no se ha estudiado de modo difundido en lactantes prematuros, con mal estado general.
Formulamos la hipótesis de que la expresión del antígeno CD64 en la superficie de los neutrófilos sería un índice sensible para la detección de la sepsis neonatal. En el presente estudio prospectivo, nuestro objetivo fue reclutar a lactantes consecutivos que se sometieron a una evaluación de la sepsis en la UCIN y determinar el índice CD64 de neutrófilos en sangre como adyuvante del sistema de puntuación hematológica validado previamente para la detección de la sepsis neonatal10,19,28.
MATERIALES Y MÉTODOSPacientesEl presente estudio fue aprobado por el Comité de Investigación en Seres Humanos de la Yale University School of Medicine. El presente estudio prospectivo se condujo en la unidad de cuidados especiales neonatales del Yale New Haven Children’s Hospital. Se reclutaron pacientes consecutivos (desde mayo de 2005 a julio de 2006) que se sometieron a una evaluación de la sepsis (considerada necesaria por el neonatólogo responsable). La duración del tratamiento antibiótico varió en función de la gravedad de la enfermedad y a discreción del neonatólogo responsable.
Para identificar a los pacientes con el objetivo de evaluarlos en busca de sepsis se usaron dos o más de las características clínicas siguientes: 1) compromiso respiratorio (taquipnea [frecuencia respiratoria > 60/min]; aumento de las apneas [interrupción de la respiración µ 20 s produciéndose a un ritmo µ 2 por hora]; apnea grave [cualquier episodio individual que requirió ventilación con presión positiva]; aumento del tratamiento de soporte ventilatorio [sin otra causa evidente, como un neumotórax] y desaturaciones [lecturas de la pulsioximetría µ 85%]); 2) compromiso cardiovascular (bradicardia [frecuencia cardíaca < 100 latidos por minuto]; palidez, disminución de la perfusión [llenado capilar µ 3 s o extremidades frías]; hipotensión); 3) cambios metabólicos (hipotermia [temperatura rectal < 36 °C], fiebre [temperatura rectal > 37 °C]; intolerancia a la alimentación [aumento de los residuos gástricos > 30% del volumen de la alimentación en, como mínimo, dos alimentaciones en un plazo de 24 h]; inestabilidad de la glucosa [glucemia < 45 o > 125 mg/ dl]; acidosis metabólica [pH < 7,25]), y 4) cambios neurológicos (letargo; hipotonía; disminución de la actividad). Estas características clínicas se han validado en un estudio previo como firmemente sugestivas de infección10.
Como parte de la evaluación, se obtuvo una muestra de sangre para un hemograma, incluida la fórmula leucocitaria, efectuar un hemocultivo y analizar el índice de CD64. Como indica-dores de sepsis se usaron, validados previamente10,19,28, los criterios hematológicos siguientes: 1) recuento absoluto de neutrófilos < 7.500 o > 14.500/mm3; 2) recuento absoluto de bandas > 1.500/mm3; 3) cociente de neutrófilos inmaduros:neutrófilos totales > 0,16, y un recuento de plaquetas < 150.000/mm3.
Todos los hemogramas se obtuvieron usando la misma técnica estéril de referencia según lo estipulado por protocolo. Para detectar hemocultivos positivos se utilizó el sistema de detección microbiana BACTEC (Becton Dickinson and Co., Sparks, MD). Es un sistema automatizado, cerrado, que utiliza un sensor químico para detectar aumentos en la producción de dióxido de carbono generado por el crecimiento de microorganismos. El sensor se monitoriza cada 10 min para un aumento de la fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de dióxido de carbono presente.
En lactantes cuyos hemocultivos fueron positivos, se estableció el diagnóstico de sepsis confirmada; en lactantes con hemocultivos negativos, aquellos con una puntuación positiva de sepsis (dos o más de los criterios hematológicos citados previamente) se clasificaron como sospecha de sepsis, mientras que los lactantes restantes se clasificaron como sin sepsis10,19,28.
Índice CD64La expresión del antígeno CD64 en neutrófilos se determinó como se ha descrito previamente29. En pocas palabras, se incubaron 50 µl de sangre completa o sangre completa diluida en suero salino neutralizado con fosfato durante 10 min a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-CD64 conjugado con una cantidad saturante de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) o un control isotípico (equipo Leuko64, Trillium Diagnostics, Scarborough, ME), seguido de una lisis de hematíes con cloruro de amonio. Las muestras se lavaron una vez y se re-suspendieron en 0,5 ml de suero salino neutralizado con fosfato con un 0,1% de albúmina sérica bovina. El análisis flujocitométrico se obtuvo utilizando un aparato FACS de Becton Dickinson (Mountainview, CA) para obtener el logaritmo de la fluorescencia verde (FITC), el logaritmo de la dispersión lateral en ángulo recto y la dispersión frontal de la luz en un mínimo de 50.000 leucocitos. La estandarización interanálisis y la cuantificación de CD64 se efectuaron utilizando microesferas de calibración FITC (Leuko64). El análisis de los datos se efectuó utilizando una ventana electrónica de dispersión de la luz para definir la población de neutrófilos y el índice de CD64 de neutrófilos se cuantificó como unidades de fluorescencia solubles equivalentes a la media usando el programa QuickCal para Winlist (Verity Software House, Topsham, ME) con una corrección para la unión de anticuerpos inespecíficos mediante la sustracción de los valores para el control isotípico.
Análisis estadísticosLas comparaciones entre el grupo con sepsis y el grupo sin ella se efectuaron utilizando la prueba de la t o un análisis de la µ2, según fue apropiado. Todos los análisis se efectuaron utilizando el programa GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software Inc.). Se generaron curvas de eficacia diagnóstica, analizadas para el área bajo la curva (AUC) y una comparación pairwise efectuada usando el programa MedCalc para Windows, versión 9.2.0.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica). Se consideróestadísticamente significativo un valor de p < 0,05.
RESULTADOSEn 163 lactantes hubo 293 episodios de evaluaciones de sepsis. Los lactantes con episodios de sepsis (confirmada o sospechada, n = 40) tuvieron una mayor edad gestacional que aquellos sin sepsis (n = 123) (media ± EEM, 34,7 ± 0,9 comparado con 32,6 ± 0,5 semanas, p = 0,03) pero su peso al nacer (2.325 ± 200 comparado con 1.969 ± 94 g) y puntuaciones de Apgar a uno y cinco minutos fueron similares (tabla 1). No se identificaron diferencias en el número de días tratados mediante ventilación con presión positiva, presión positiva continua nasal de las vías respiratorias, oxigenoterapia suplementaria o duración de la hospitalización entre grupos (tabla 1).
TABLA 1. Características de la población neonatal
Partiendo del sistema de puntuación de la sepsis utilizando las variables hematológicas, los episodios de sepsis (n = 128) se caracterizaron por recuentos de leucocitos, recuentos absolutos de neutrófilos, recuentos absolutos de bandas y cocientes I/T significativamente mayores que los episodios no sépticos (n = 165), al igual que recuentos más bajos de plaquetas (p < 0,001 para todas las comparaciones; tabla 2). En los episodios de sepsis también se demostraron valores significativa-mente mayores del índice CD64 que en aquellos sin sepsis (5,61 ± 0,85 comparado con 2,63 ± 0,20, p = 0,0002; tabla 2). Para todos los episodios de sepsis, el índice CD64 tuvo un área bajo la curva (AUC) de 0,739; la utilización de un punto de corte del índice CD64 de 2,30 deparó por sí misma una sensibilidad del 70% y una especificidad del 62%, con un valor predictivo negativo (VPN) del 73%.
TABLA 2. Características de los episodios de sepsis
En la tabla 3 se muestran la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y VPN de todos los datos hematológicos solos y en combinación con el índice CD64 (corte de 2,30). La combinación de este valor de corte del índice CD64 con los criterios predefinidos del recuento absoluto de neutrófilos en Métodos deparó la mayor sensibilidad (95%) y el mayor valor predictivo negativo del 93%. No se efectuó una combinación de los múltiples índices hematológicos para la sensibilidad y los valores predictivos puesto que en el presente estudio la base para definir la sepsis fue µ 2 índices hematológicos positivos; esta definición a priori produciría un sesgo positivo hacia valores predictivos más altos. Por esta razón, sólo examinamos las variables individuales ± el índice CD64 experimental.
TABLA 3. Sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo (expresados en porcentaje) de todos los datos hematológicos solos y combinados con el índice CD64
Hubo 10 episodios de sepsis confirmada con hemocultivos positivos, 4 fueron por especies de Staphylococcus coagulasa negativos, 2 por E. coli y uno por Streptococcus de grupo B, uno por Klebsiella oxytoca, uno por Klebsiella pneumoniae y uno por especies de Enterobacter. Para estos episodios de sepsis confirmada, entre todos los parámetros de laboratorio, para el índice CD64 se identificó la mayor área bajo la curva (AUC: 0,852) mediante el análisis de eficacia diagnóstica (fig. 1 y tabla 4). Las comparaciones pairwise de las curvas de eficacia diagnóstica de los diversos parámetros hematológicos con el índice CD64 no demostraron diferencias significativas con el recuento absoluto de bandas o el cociente I/T, identificándose una tendencia hacia un mayor valor del índice CD64 comparado con los recuentos de plaquetas (p = 0,086) y significativamente mayor comparado con los recuentos absolutos de neutrófilos (p = 0,009). Un corte del índice CD64 de 2,02 deparó por sí mismo una sensibilidad del 80% y una especificidad del 79% para el diagnóstico de episodios de sepsis con hemocultivo positivo.
TABLA 4. Comparación de las AUC de las curvas de eficacia diagnóstica
Fig. 1. Análisis de la curva de eficacia diagnóstica de los parámetros hematológicos en los episodios de sepsis confirmada (n = 10). El valor del antígeno CD64 se caracterizó por la mayor área bajo la curva (AUC: 0,852). I: inmaduros; Plq.: recuento de plaquetas; RAB: recuento absoluto de bandas; RAN: recuento absoluto de neutrófilos; T: totales.
DISCUSIÓNAntes de recibir el resultado del hemocultivo es difícil identificar a recién nacidos con sepsis. Puesto que la sepsis es una posibilidad aun cuando los resultados del hemocultivo sean negativos (p. ej., si el recién nacido se ha expuesto in utero a los antibióticos), los médicos pueden optar por continuar los antibióticos partiendo del perfil clínico. En un estudio multicéntrico, Fanaroff et al documentaron la incidencia, características de la presentación y factores de riesgo de sepsis de inicio tardío en lactantes de muy bajo peso al nacer30. Aunque se estudió un total de 2.416 lactantes, sólo 395 con sepsis demostrada mediante hemocultivo desarrollaron septicemia a una edad mediana de 17 días. Las características clínicas de los lactantes con sepsis incluyeron apnea (55%); intolerancia a la alimentación, distensión abdominal y heces positivas a la prueba del guayaco (43%); aumento del tratamiento de soporte respiratorio (29%) y letargo e hipotonía (23%). En otro estudio se han utilizado hallazgos clínicos similares para identificar a recién nacidos con sepsis10. Sin embargo, con la excepción del aumento de los episodios de apnea y bradicardia, los criterios clínicos no pudieron distinguir a lactantes infectados de los no infectados10 (utilizando “el patrón oro” del hemocultivo positivo). Al igual que los mencionados previamente, en el presente estudio el microorganismo implicado con mayor frecuencia en la sepsis neonatal fue Staphylococcus coagulasa negativo1,5,10,30,31.
Los estudios que han usado las diferencias de temperatura periférica-central para identificar a lactantes con sepsis han descrito resultados prometedores pero no se han validado en estudios efectuados con un mayor número de lactantes16,32. Recientemente, Griffin et al han utilizado las características de la frecuencia cardíaca para predecir la infección y la muerte neonatal17, pero esto requiere confirmación.
Numerosos esfuerzos se han centrado en los parámetros hematológicos con el objetivo de aumentar el rendimiento diagnóstico en la sepsis neonatal. Rodwell et al33 evaluaron el papel de los hallazgos hematológicos como prueba de cribado de la sepsis neonatal; en dicho estudio, se evaluaron 298 lactantes en busca de sepsis, y 27 experimentaban sepsis demostrada mediante hemocultivo (lo que es similar a las tasas obtenidas en el presente estudio). De estos 27, en 26 (96%) se identificaron µ 3 criterios hematológicos en el momento del episodio de sepsis. Se concluyó que la presencia de µ 3 puntuaciones hematológicas tuvo una sensibilidad del 96% y una especificidad del 78%. Estos criterios también se caracterizaron por un valor predictivo positivo del 31% y un valor predictivo negativo del 99%. En otros estudios para diferenciar a lactantes con y sin sepsis se han usado los criterios modificados de Rodwell10,19,28. Sin embargo, es preciso tener en cuenta la amplia variabilidad en la precisión diagnóstica de los índices de los leucocitos en la sepsis neonatal34, en particular el recuento de bandas y su cociente I/T derivado.
También se ha investigado la determinación de citocinas como un medio de aumentar el rendimiento en la sepsis neonatal. Entre las diversas citocinas, la mayor parte de estudios han confirmado la utilidad de la inter-leucina10,11,24,35-46 (IL-6) como un marcador precoz de sepsis neonatal. Los valores de corte de esta interleucina para el diagnóstico de sepsis han fluctuado de 18 a 31 pg/ml 10,11,44,45. Por otra parte, la IL-8 no ha estado a la altura de las promesas iniciales como marcador diagnóstico de la sepsis neonatal10,24,47,48. También es importante destacar que, aunque los inmunoanálisis manuales pueden proporcionar resultados a las 1,5-4 h, serían necesarios los procesos automatizados disponibles fácilmente para la determinación de citocinas si sus valores han de ayudar a las decisiones clínicas de iniciar o suspender el tratamiento con antibióticos25. La falta de automatización y los costes implicados en los inmunoanálisis manuales han dificultado aun más la aceptación de estos marcadores en la práctica clínica general. Los reactantes de fase aguda, por ejemplo, la procalcitonina y la proteína C re-activa, también se han estudiado como marcadores de la sepsis neonatal22,23,34,45,48. Lamentablemente, puesto que esos reactantes de fase aguda tienen propiedades diagnósticas similares, no se ha puesto de manifiesto que un marcador individual tenga una ventaja significativa sobre el otro26.
Recientemente, se han estudiado una diversidad de marcadores de la superficie de los leucocitos para evaluar su potencial como marcadores de la sepsis neonatal (revisados26). En la superficie de los neutrófilos se observa un aumento sustancial de la expresión del antígeno CD64 como respuesta a la infección bacteriana en recién nacidos, similar a lo observado en niños más mayores y adultos49. La expresión de CD64 es un indicador muy específico de sepsis neonatal pero en un estudio de publicación reciente se ha documentado una baja sensibilidad50. En niños de muy bajo peso al nacer, utilizando valores de corte de 6.136 y 4.000 moléculas de ficoeritrina unidas por célula, respectivamente, se ha identificado que la concentración de CD64 se caracteriza por una elevada sensibilidad (95-97%) y valor predictivo negativo (97-99%) en la infección de inicio precoz y tardío51,52. La adición de la concentración de IL-6 o la proteína C reactiva mejoró adicionalmente la sensibilidad y especificidad hasta el 100%52. Por lo tanto, en el presente estudio prestamos atención al antígeno CD64 como adyuvante diagnóstico de los índices hematológicos de referencia.
Utilizando flujocitometría la cuantificación de CD64 es rápida (< 60 min) y requiere un volumen mínimo de sangre. De hecho, para el presente estudio, no se obtuvieron muestras adicionales de sangre de los recién nacidos para realizar esta prueba; las muestras remitidas para el hemograma fueron suficientes. En el presente estudio, identificamos que el índice CD64 tuvo la mayor AUC comparado con los parámetros hematológicos de uso habitual (incluido el recuento de bandas y el cociente I/T) para diagnosticar la sepsis neonatal confirmada. Este hallazgo sólo justifica estudios prospectivos adicionales del antígeno CD64 en las evaluaciones de la sepsis neonatal. Además, CD64 demostró una utilidad sorprendente en todos los episodios de sepsis, incluso dado el uso a priori de otros índices hematológicos para establecer esta definición. De hecho, la combinación de los criterios del índice CD65 y el recuento absoluto de neutrófilos, sin otros índices hematológicos, demostró una sensibilidad del 95% para todos los episodios de sepsis y un valor del 93% para predecir los episodios que no se ajustaban a los criterios sépticos. Estos hallazgos sugieren firmemente que el índice CD64 objetivo podría reemplazar el recuento de bandas (y su cociente I/T derivado) como indicador hematológico de la sepsis. Además, el elevado valor predictivo negativo de la combinación CD64/recuento absoluto de neutrófilos sugiere que estos dos valores podrían ser satisfactorios en la toma de decisiones de suspender o no administrar tratamiento antibiótico. Están justificados estudios adicionales sobre una comparación directa del índice CD64 con el recuento de bandas y el cociente I/T para determinar si el primero puede reemplazar a estos criterios subjetivos junto con el recuento absoluto de neutrófilos.
CONCLUSIONESPara concluir, el índice CD64 aumentó significativa-mente durante los episodios de sepsis neonatal y fue el parámetro más satisfactorio para el diagnóstico de sepsis confirmada; junto con el recuento absoluto de neutrófilos, este índice parece prometedor para reemplazar la determinación subjetiva del recuento de bandas y el cociente I/T. Sin embargo, antes de que pueda aceptarse en los ámbitos clínicos habituales, deben evaluarse cuidadosamente aspectos decisivos, como la disponibilidad y el coste. No obstante, de acuerdo con otros estudios publicados, los hallazgos del presente estudio alientan a incorporar el índice CD64 en los sistemas de puntuación de sepsis en los recién nacidos y evaluar prospectivamente su valor diagnóstico incremental (o como sustitución de los parámetros tradicionales).
AGRADECIMIENTOEl presente estudio se financió con una beca de Trillium Diagnostics, LLC.
Deseamos expresar nuestro agradecimiento a las enfermeras de la UCIN por su ayuda inestimable.
Correspondencia: Vineet Bhandari, MD, DM, Department of Pediatrics, Division of Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, LCI 401B, PO Box 208064, New Haven, CT 06520-8064, Estados Unidos.
Correo electrónico: vineet.bhandari@yale.edu