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Vol. 37. Núm. 5.
Páginas 319-323 (Mayo 2019)
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Vol. 37. Núm. 5.
Páginas 319-323 (Mayo 2019)
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DOI: 10.1016/j.eimc.2018.06.018
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Comparación de tres procedimientos para la identificación rápida de microorganismos causantes de bacteriemias. Evaluación de su eficacia y aplicabilidad en el laboratorio de microbiología
Comparison of three procedures for the rapid identification of bacteraemia-causing microorganisms. Evaluation of their effectiveness and applicability to microbiology laboratories
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Oriol Martín-Pujol, Tomas Tosco-Nuñez
Autor para correspondencia
tomastn@hotmail.com

Autor para correspondencia.
, Isabel de Miguel-Martinez
Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Insular de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria, España
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Tabla 1. Resultados de identificación por MALDI-TOF desglosados por microorganismo y métodos empleados. Los resultados se interpretaron con los criterios de Kohlmann
Tabla 2. Resultados obtenidos por Sepsityper®, el método casero con saponina y el subcultivo de incubación corta, en función del criterio de interpretación aplicado a las puntuaciones obtenidas mediante EM MALDI-TOF
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Resumen
Introducción

Evaluamos tres procedimientos de identificación rápida de microorganismos a partir de hemocultivos positivos.

Métodos

Aplicamos dos métodos basados en la extracción directa desde el frasco de hemocultivo: Sepsityper® (Bruker Daltonics) (ST) y un método casero con saponina (MCS), y un tercer método basado en un subcultivo con incubación corta (SIC). Se comparan las identificaciones por espectrometría de masas Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (EM-MALDI-TOF) aplicando los criterios de interpretación del fabricante y los puntos de corte corregidos (PCC).

Resultados

Aplicando los criterios del fabricante se identificaron a nivel de especie el 65,8%, el 45,8% y el 57,4% con ST, MCS y SIC, respectivamente. Aplicando los PCC, estos resultados fueron del 92,3%, del 80,6%, y del 85,2%, respectivamente. La identificación con ST fue significativamente mejor que el MCS. ST y SIC no mostraron diferencias significativas, excepto en levaduras.

Conclusiones

ST y SIC obtienen buenas tasas de identificación y pueden integrarse fácilmente en cualquier laboratorio.

Palabras clave:
Hemocultivos
Bacteriemia
Identificación
Métodos rápidos
MALDI-TOF
Abstract
Introduction

Three procedures for rapid identification of microorganisms in positive blood cultures were evaluated.

Methods

We performed two methods based on direct extraction from a blood culture: Sepsityper® (Bruker Daltonics) (ST) and a non-commercial saponin method (MCS), and another method consisting of a short incubation subculture (SIC). Identification values obtained by spectrometry Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (EM MALDI-TOF) were compared by applying the manufacturer's interpretation criteria and corrected cut-off points.

Results

According to the manufacturer, 65.8%, 45.8% and 57.4% of microorganisms were identified at the species level by using ST, MCS and SIC, respectively. When applying corrected cut-off points, the values increased to 92.3%, 80.6% and 85.2%, respectively. ST offered significantly better results than MCS, and no significant differences were found between ST and SIC, except for with respect to yeast.

Conclusions

Better identification rates were obtained by using ST and SIC, which are easily applicable in any laboratory.

Keywords:
Blood cultures
Bacteraemia
Identification
Rapid methods
MALDI-TOF
Texto completo
Introducción

Instaurar una terapia antibiótica empírica efectiva supone mejorar el pronóstico de los pacientes y reducir el tiempo de hospitalización y los costes sanitarios asociados1.

Köck et al.2 encontraron que los clínicos cambiaban los tratamientos empíricos al 20% de los pacientes después de conocer la identificación de la especie, frente al 8% cuando solo tenían los resultados de la microscopía. En base a datos como estos, se han desarrollado nuevos métodos basados en identificaciones mediante espectrometría de masas tipo Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) a partir de botellas de hemocultivo positivas, tanto de forma directa utilizando técnicas de extracción comerciales o caseras3-10, como indirecta a partir de subcultivos de incubación corta11-14. En cuanto a la interpretación de las puntuaciones obtenidas por MALDI-TOF, Kohlmann et al.11 publicaron unos puntos de corte corregidos (PCC) basados en si los microorganismos eran grampositivos o no.

El primer objetivo de este estudio fue valorar la eficacia de tres procedimientos para la identificación rápida de microorganismos a partir de hemocultivo positivo y su aplicabilidad en la rutina del laboratorio. El segundo objetivo fue comparar las puntuaciones obtenidas por MALDI-TOF aplicando los criterios de interpretación del fabricante y los propuestos por Kohlmann et al., para evaluar cómo afectan en la identificación final de los microorganismos.

Material y métodos

Se presenta un estudio observacional comparativo realizado entre 2014 y 2016 que evalúa tres métodos para la identificación rápida de patógenos a partir de hemocultivos positivos.

Se consideró una botella por paciente y episodio de bacteriemia. Se empleó el sistema BacT/ALERT (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). Los frascos positivos se procesaron siguiendo los protocolos habituales. Tras 24h de incubación, los microorganismos aislados fueron identificados por MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) y por pruebas bioquímicas automatizadas (MicroScan WalkAway, Beckman Coulter, EE.UU.). En el caso de Streptococcus pneumoniae y estreptococos del grupo viridans, las identificaciones se confirmaron mediante sensibilidad a la optoquina y solubilidad en bilis. Se excluyeron los hemocultivos positivos en los que la tinción de Gram revelaba una etiología polimicrobiana.

De la primera botella positiva de cada paciente estudiado se obtuvieron tres alícuotas para evaluar los procedimientos siguientes:

  • 1)

    Sepsityper® Kit (ST) (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Se procesa 1ml del hemocultivo según las especificaciones del fabricante y se realiza la extracción etanol/fórmico. Posteriormente, se deposita 1μl del sobrenadante en una placa metálica.

  • 2)

    Método casero con saponina (MCS). Basado en la modificación del protocolo de Martiny et al.5. Se extrae 1ml del frasco de hemocultivo, se añaden 500μl de una solución de saponina al 5% y tras agitación con vórtex (10s), se deja reposar 5min a temperatura ambiente. Se realizan dos lavados con agua miliQ. Posteriormente se procede a la extracción etanol/ácido fórmico y se deposita 1μl del sobrenadante en una placa metálica.

  • 3)

    Subcultivo de incubación corta (SIC). Se inoculan 10 gotas (≈500μl) del hemocultivo en un medio de agar chocolate (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) y se incuba en estufa a 37°C, 5% CO2 durante 3,5h. Tras este tiempo, con un asa estéril, se realizan varios arrastres sobre la zona de inoculación y se añade a la placa metálica. A continuación, se realiza una extracción directa en placa con ácido fórmico ≥96%.

Identificación mediante MALDI-TOF

Sobre los inóculos de la placa, se añadió 1μl de solución matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinámico) y se dejó secar a temperatura ambiente. A continuación, se introdujo la placa en el sistema MALDI-TOF. Se utilizó el calibrador Bacterial Test Standard, y para el análisis de cada muestra, el espectrómetro de masas Microflex LT y el software Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania).

Los criterios de interpretación del fabricante establecen los valores ≥2,3 como alta probabilidad de identificación, entre 2 y 2,2 como probable identificación a nivel de especie, entre 1,7 y 1,9 como probable identificación a nivel de género, y los valores <1,7 se interpretan como poco fiables. Los PCC publicados por Kohlmann et al.11 consideran identificaciones correctas a nivel de género y especie aquellas con una puntuación ≥1,5 para microorganismos grampositivos y ≥1,7 para el resto de microorganismos. Además, como criterio adicional, las tres primeras opciones de identificación deben ser idénticas o, en su defecto, que las dos primeras sean idénticas con una diferencia mayor de 0,3 con la tercera. Puntuaciones diferentes a lo anterior se consideran poco fiables. Las identificaciones directas propuestas por MALDI-TOF que no se correspondieron con las definitivas del subcultivo tradicional se consideraron incorrectas.

Análisis estadístico

Se empleó la prueba t de Student con una distribución binomial para la comparación entre los métodos utilizados. Se analizaron el total de identificaciones correctas y poco fiables/incorrectas para cada método y también se realizó un análisis por subgrupos (microorganismos grampositivos, gramnegativos y levaduras).

Resultados

Se analizaron 155 frascos de hemocultivo (90 aerobios y 65 anaerobios): 89 (57,4%) aislamientos de microorganismos grampositivos, 53 (34,2%) gramnegativos y 13 (8,4%) levaduras. Se identificaron 33 especies diferentes. Los resultados globales por microorganismo y método, aplicando los PCC11, se presentan en la tabla 1. En la tabla 2 se indican los resultados de cada método, según el criterio de interpretación.

Tabla 1.

Resultados de identificación por MALDI-TOF desglosados por microorganismo y métodos empleados. Los resultados se interpretaron con los criterios de Kohlmann

Sepsityper®Método casero con saponinaSubcultivo de incubación corta
ID tras subcultivo tradicional  N total  ID correcta (especie)  IDPF/No ID  ID correcta (especie)  IDPF/No ID  ID correcta (especie)  IDPF/No ID 
Bacterias gramnegativas  53  51 (96,2%)  2 (3,8%)  46 (86,8%)  7 (13,2%)  49 (92,5%)  4 (7,5%) 
Enterobacterias  38  38 (100%)    36 (94,7%)  2 (5,3%)  36 (94,7%)  2 (5,3%) 
Citrobacter freundii       
Escherichia coli  21  21    20  19 
Klebsiella pneumoniae     
Klebsiella oxytoca       
Morganella morganii       
Proteus mirabilis       
Salmonella sp.       
Serratia marcescens       
No fermentadores  13  13 (100%)    10 (76,9%)  3 (23,1%)  12 (92,3%)  1 (7,7%) 
Pseudomonas aerugiosa  12  12    10  12   
Pseudomonas oryzihabitans       
Otros     
Haemophilus influenzae       
Helicobacter cinaedi       
Bacterias grampositivas  89  84 (94,4%)  5 (5,6%)  77 (86,5%)  12 (13,5%)  82 (92,1%)  7 (7,9%) 
Cocos grampositivos  87  83 (95,4%)  4 (4,6%)  77 (88,5%)  10 (11,5%)  82 (94,3%)  5 (5,7%) 
Staphylococcus spp.  56  56 (100%)    55 (98,2%)  1 (1,8%)  55 (98,2%)  1 (1,8%) 
Staphylococcus aureus  16  16    16    16   
Coagulasa negativa  40  40    39  39 
Staphylococcus capitis       
Staphylococcus epidermidis  23  23    23    23   
Staphylococcus haemolyticus       
Staphylococcus hominis  12  12    11  11 
Staphylococcus lugdunensis       
Enterococcus spp.  16  16 (100%)    12 (75%)  4 (25%)  16 (100%)   
Enterococcus faecalis       
Enterococcus faecium     
Streptococcus spp.  15  11 (73,3%)  4 (26,7%)  10 (66,7%)  5 (33,3%)  11 (73,3%)  4 (26,7%) 
Streptococcus agalactiae       
Streptococcus anginosus       
Streptococcus canis       
Streptococcus gallolyticus     
Streptococcus mitis       
Streptococcus oralis     
Streptococcus pneumoniae 
Bacilos grampositivos     
Lactobacillus rhamnsosus       
Propionibacterium acnes       
Levaduras  13  8 (61,5%)  5 (38,5%)  2 (15,4%)  11 (84,6%)  1 (7,7%)  12 (92,3%) 
Candida albicans   
Candida glabrata       
Candida parapsilosis   
Candida tropicalis       
Total aislamientos  155  143 (92,3%)  12 (7,7%)  125 (80,6%)  30 (19,4%)  132 (85,2%)  23 (14,8%) 

ID: identificación; IDPF/No ID: identificación poco fiable/no identificación.

Tabla 2.

Resultados obtenidos por Sepsityper®, el método casero con saponina y el subcultivo de incubación corta, en función del criterio de interpretación aplicado a las puntuaciones obtenidas mediante EM MALDI-TOF

    Sepsityper®Método casero con saponinaSubcultivo de incubación corta
Microorganismos aislados  ID correcta (género)
Fabricante 
ID correcta (especie)
Fabricante 
ID correcta (especie)
PCC 
ID correcta (género)
Fabricante 
ID correcta (especie)
Fabricante 
ID correcta (especie)
PCC 
ID correcta (género)
Fabricante 
ID correcta (especie)
Fabricante 
ID correcta (especie) PCC 
Bacilos gramnegativos  53  51 (96,2%)  47 (88,7%)  51 (96,2%)  47 (88,7%)  32 (60,4%)  46 (86,8%)  49 (92,4%)  43 (81,1%)  49 (92,5%) 
Enterobacterias  38  28 (73,7%)  27 (71,1%)  38 (100%)  36 (94,7%)  27 (71,1%)  36 (94,7%)  36 (94,7%)  33 (86,8%)  36 (94,7%) 
No fermentadores  13  13 (100%)  10 (76,9%)  13 (100%)  11 (84,6%)  5 (38,5%)  10 (76,9%)  12 (92,3%)  9 (69,2%)  12 (92,3%) 
Otros   
Cocos grampositivos  87  82 (94,2%)  54 (62,1%)  83 (95,4%)  64 (73,6%)  39 (44,8%)  77 (88,5%)  79 (90,8%)  46 (52,9%)  82 (92,1%) 
Estafilococos  56  56 (100%)  34 (60,7%)  56 (100%)  46 (82,1%)  31 (55,4%)  55 (98,2%)  55 (98,2%)  27 (48,2%)  55 (98,2%) 
Staphylococcus aureus  16  16  15  16  16  13  16  16  16  16 
SCN  40  40  19  40  40  18  39  39  11  39 
Enterococos  16  15 (93,8%)  12 (75,0%)  16 (100%)  11 (68,7%)  8 (50,0%)  12 (75%)  15 (93,7%)  13 (81,3%)  16 (100%) 
Estreptococos  15  11 (73,3%)  8 (53,3%)  11 (73,3%)  7 (46,7%)  10 (66,7%)  9 (60,0%)  6 (40,0%)  11 (73,3%) 
Bacilos grampositivos  1 (50%)  1 (50%) 
Levaduras  13  8 (61,5%)  1 (7,7%)  8 (61,5%)  2 (15,4%)  2 (15,4%)  1 (7,7%)  1 (7,7%) 
Total aislamientos  155  142 (91,6%)  102 (65,8%)  143 (92,3%)  113 (72,9%)  71 (45,8%)  125 (80,6%)  129 (83,2%)  89 (57,4%)  132 (85,2%) 

ID: identificación; PCC: puntos de corte corregidos.

Todas las identificaciones obtenidas siguiendo los tres métodos estudiados coincidieron con la identificación del subcultivo tradicional, excepto en dos cepas identificadas inicialmente como estreptococos del grupo viridans, que, tras pruebas manuales, se identificaron finalmente como Streptococcus pneumoniae.

El ST obtuvo resultados significativamente mejores (p<0,05) respecto al MCS en la identificación de los microorganismos. El ST y el SIC no mostraron diferencias significativas ni para gramnegativos (p=0,094) ni para grampositivos (p=0,234); solo en el análisis de levaduras se obtuvo una p<0,05 a favor de ST. Por último, se encontraron diferencias significativas (p<0,05) tanto en la identificación de gramnegativos como en la de grampositivos tras comparar el MCS y el SIC, obteniéndose los mejores resultados con este último.

Discusión

Analizamos la eficacia de tres métodos para la identificación rápida de microorganismos a partir de hemocultivos positivos. Los métodos con mejores resultados a nivel de especie, aplicando los criterios del fabricante, fueron el ST (65,8%) y el SIC (57,4%). Solo presentaban diferencias significativas en la identificación de levaduras, siendo mejor cuando se utilizaba el método comercial. El MCS obtuvo resultados significativamente inferiores (45,8%) comparados con los demás métodos.

Aplicando los PCC11, los porcentajes de identificación correcta a nivel de especie se incrementaron: ST (92,3%), SIC (85,2%) y MCS (80,6%), lo que confirma que los puntos de corte del fabricante se podrían modificar sin perder especificidad12,15.

Los resultados para ST son similares a los ya publicados, en los que las identificaciones correctas a nivel de especie, aplicando criterios del fabricante, oscilan entre el 59,5 y el 82,8%3-6. Con respecto al SIC, nuestros resultados son similares a los existentes en la literatura11,13,14. En cuanto al MCS, las modificaciones del protocolo de Martiny et al.5 permiten obtener mejores resultados cuando se aplican los PCC11.

Para la identificación de bacterias gramnegativas a nivel de especie aplicando PCC11, tanto el ST como el SIC mostraron resultados excelentes (96,2 y 92,5%, respectivamente). El MCS, aunque fue estadísticamente inferior (p<0,05) para la identificación global de bacterias gramnegativas, en el caso de enterobacterias resultó comparable con los demás métodos.

También se obtuvieron resultados óptimos para bacterias grampositivas aplicando PCC11 con ST (94,4%) y con SIC (92,1%), siendo superiores las identificaciones de estafilococos y enterococos en comparación con las de estreptococos. Es relativamente habitual no poder discriminar entre Streptococcus pneumoniae y estreptococos del grupo viridans debido a la similitud entre sus espectros proteicos. Hay que destacar que todas las cepas de Staphylococcus aureus fueron identificadas correctamente por los tres métodos y que ningún estafilococo coagulasa negativa fue identificado erróneamente como S.aureus.

Los porcentajes de identificación correcta de las levaduras fueron inferiores al resto, siendo el ST (61,5% aplicando PCC11) estadísticamente superior a los otros métodos.

En cuanto a la aplicabilidad de estas técnicas en el laboratorio, el ST es rápido (20min) pero conlleva un tiempo superior de procesamiento técnico y mayor coste económico. Sin embargo, con el SIC el resultado se obtiene más tarde (3,5h) pero necesita menor procesamiento técnico y es más económico, por lo que puede integrarse fácilmente en la rutina del laboratorio.

Por tanto, como ST y SIC tienen tasas de identificación comparables, a excepción de las levaduras, ambas técnicas podrían combinarse según la hora de positivización de los hemocultivos y la logística del laboratorio, de tal forma que se mantendría una información clínica continua con un uso sostenible de los recursos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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