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Vol. 35. Núm. 3.
Páginas 151-154 (Julio - Septiembre 2018)
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Vol. 35. Núm. 3.
Páginas 151-154 (Julio - Septiembre 2018)
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DOI: 10.1016/j.riam.2018.02.002
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Identificación de levaduras del género Candida: los métodos convencionales frente a MALDI-TOF MS
Identification of Candida yeasts: Conventional methods and MALDI-TOF MS
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Ivana Maldonadoa,
Autor para correspondencia
ivanam27@gmail.com

Autor para correspondencia.
, Silvana Cataldib, Claudia Garbaszc, Silvia Rellosof, Pablo Striebecka, Liliana Guelfandd, Laura López Morale, Red de Micología de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (RMCABA), Argentina
a Hospital Alemán, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
b Hospital General de Agudos C. G. Durand, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
c Hospital General de Agudos I. Pirovano, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
d Hospital General de Agudos J. A. Fernández, Argentina
e Hospital Ciudad Autónoma de Buenos Aires Cosme Argerich, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
f Centro de Educación Médica e Investigaciones Clínicas Norberto Quirno (CEMIC), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina
Red de Micología de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires:
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Tabla 1. Aislamientos clínicos y cepas ATCC evaluados de especies de Candida
Tabla 2. Resultados de la identificación de levaduras según el método convencional (API), por técnica proteómica (MALDI-TOF MS) e identidades discrepantes confirmadas por genómica (ITS)
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Resumen
Antecedentes

Las infecciones fúngicas invasivas han ido aumentando y las levaduras del género Candida son la principal causa de las mismas. Las especies distintas de Candida albicans son cada vez más frecuentes y algunas pueden presentar patrones variables de sensibilidad a los antimicóticos, por lo que es importante la correcta identificación de la especie. Los métodos de identificación convencionales con los que cuentan la mayoría de los laboratorios pueden presentar inconvenientes. La espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) surgió como una alternativa a los mismos.

Objetivos

Evaluar la concordancia de los resultados de identificación de diferentes especies de Candida mediante dostécnicas: una convencional (galerías API) y MALDI-TOF MS.

Métodos

Se analizaron las siguientes especies y número de aislamientos: Candida parapsilosis (28), Candida glabrata (34), Candida krusei (24), Candida tropicalis (45), Candida guilliermondii (30), C. albicans (28), Candida dubliniensis (6), Candida kefyr (1) y Candida lipolytica (1) del cepario de RMCABA; también se utilizaron las cepas C. parapsilosis 22019, C. glabrata 90030, C. krusei 6258 y C. albicans 68548, pertenecientes a la American Type Culture Collection (ATCC). Las discrepancias en la identificación se resolvieron mediante genotipificación.

Resultados y conclusiones

La concordancia directa entre la identificación convencional y MALDI-TOF MS fue del 92,5% (186/201).

Palabras clave:
Candida spp.
MALDI-TOF MS
Identificación de levaduras
Abstract
Background

Invasive fungal infections are increasing, and Candida yeasts are the main cause. Species other than Candida albicans are becoming more frequent, and some of them may have variable patterns of susceptibility to antifungal agents, making it important to identify them correctly. Conventional identification methods used by most laboratories may present with drawbacks. Mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has emerged as an alternative method.

Aims

The aim of this study was to evaluate the concordance of the identification, at species level, by conventional methods (API) and MALDI-TOF MS.

Methods

The following species and number of isolates were studied: Candida parapsilosis (28), Candida glabrata (34), Candida krusei (24), Candida tropicalis (45), Candida guilliermondii (30), C. albicans (28), Candida dubliniensis (6), Candida kefyr (1), and Candida lipolytica (1) from the strain collection of Autonomous City of Buenos Aires Mycology Network (RMCABA). The strains C. parapsilosis 22019, C. glabrata 90030, C. krusei 6258 and C. albicans 68548 from the American Type Culture Collection (ATCC) were also included. Discrepancies were resolved by genotyping.

Results and conclusions

The direct concordance between the conventional identification method and MALDI-TOF MS was 92.5% (186/201).

Keywords:
Candida spp.
MALDI-TOF MS
Yeast identification
Texto completo

En los últimos años se ha observado un incremento en las infecciones fúngicas invasivas. Las especies de Candida distintas de Candida albicans se recuperan cada vez con más frecuencia y pueden presentar patrones variables de sensibilidad a los antifúngicos, por lo que es muy importante identificarlas correctamente1,5,12.

Los métodos de identificación convencionales incluyen estudios micromorfológicos, medios cromogénicos y sistemas comerciales basados en pruebas bioquímicas. Estos presentan inconvenientes, tales como un tiempo de identificación prolongado, bases de datos limitadas e identificaciones incorrectas14. La espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) surgió como una alternativa a los mismos1,10.

La mayoría de los laboratorios asistenciales de nuestro país cuenta con métodos convencionales para la identificación de levaduras de importancia clínica. El objetivo del estudio fue evaluar la concordancia en los resultados de la identificación de especies de Candida obtenidos por dosmetodologías: una convencional (galerías API) y otra novedosa (MALDI-TOF MS).

Materiales y métodos

Se analizaron 197 aislamientos de Candida: 28 Candida parapsilosis, 34 Candida glabrata, 24 Candida krusei, 45 Candida tropicalis, 30 Candida guilliermondii, 28C. albicans, 6 Candida dubliniensis, 1 Candida kefyr y 1 Candida lipolytica, provenientes de materiales clínicos; se incluyeron las cepas de la colección ATCC C. parapsilosis 22019, C. glabrata 90030, C. krusei 6258 y C. albicans 68548 (tabla 1). Todos los aislamientos fueron identificados por métodos convencionales y MALDI-TOF MS. Las discrepancias se resolvieron mediante genotipificación.

Tabla 1.

Aislamientos clínicos y cepas ATCC evaluados de especies de Candida

Especie según galería API  Aislamientos (n)  Cepas ATCC 
Complejo C. parapsilosis  28 
Complejo C. glabrata  34 
C. krusei  24 
C. tropicalis  45   
C. guilliermondii  30   
C. albicans  28 
C. dubliniensis   
C. kefyr   
C. lipolytica   
Total  197 
Identificación convencional

A todos los aislamientos se les realizó un estudio micromorfológico en agar harina de maíz con 1% de Tween 80 (Corn-Meal agar, Oxoid, Reino Unido) y se sembraron en agar cromogénico para levaduras (CHROMagarTM Candida, París, Francia). Para la identificación según el patrón de asimilación de azúcares se utilizaron las galerías API® ID 32C o API® 20C AUX (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). Además, se incluyeron otras pruebas bioquímicas para diferenciar C. albicans de C. dubliniensis13.

Análisis por MALDI-TOF MS

Los resultados se leyeron y analizaron por el sistema Bruker Microflex LT versión 3.1 (Bruker Daltonics, Alemania). Se consideró un score mayor o igual a 1,7 como identificación aceptable de la especie, entre 1,5 y 1,6 identificación aceptable del género, y menor o igual a 1,5 como identificación no fiable. La identificación se realizó a partir de un extendido directo de la colonia con 1μl de ácido fórmico al 70% (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia) y 1μl de matriz alfa-ciano-4 hidroxi-ácido cinámico (Bruker Daltonics, Alemania). Cuando los scores fueron < 1,70, se realizó el método de extracción en tubo con etanol absoluto (Sigma-Aldrich, Francia) y acetonitrilo al 100% (Sigma-Aldrich), siguiendo las indicaciones dadas por el fabricante Bruker Daltonics.

Identificación genotípica

Para cada aislamiento discordante se realizó la extracción de ADN según Silva et al.17. Se emplearon los primers universales ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). Los productos de amplificación fueron purificados y secuenciados con ABI 3730xl (Applied Biosystems, EE. UU.). Para la identificación se empleó la herramienta BLAST y se estableció como criterio una concordancia > 97% y una cobertura de al menos el 99%.

Métodos estadísticos

Se aplicó la prueba de concordancia kappa8 para la estimación de la concordancia entre ambas técnicas diagnósticas, y el programa estadístico EpiDat 4.1 versión 2014 (Consellería de Sanidade, Xunta de Galicia, España; Organización Panamericana de la Salud; Universidad CES, Colombia; http://dxsp.sergas.es).

Resultados y discusión

La tabla 2 muestra los resultados obtenidos con ambas metodologías. El porcentaje de acuerdo o concordancia directa entre la identificación convencional y la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) fue del 92,5% (IC del 95%: 91,64-93,43) (186 aislamientos de 201), y un índice kappa igual a 0,751 (IC del 95%: 0,633-0,869), lo que indica una buena concordancia entre ambas técnicas diagnósticas. Se observaron discrepancias con las siguientes especies y número de aislamientos: C. parapsilosis (3/29); C. glabrata (5/35); C. krusei (1/25); C. tropicalis (2/45); C. guilliermondii (3/30) y C. dubliniensis (1/6). No hubo discordancia entre los resultados obtenidos mediante secuenciación y los de MALDI-TOF MS.

Tabla 2.

Resultados de la identificación de levaduras según el método convencional (API), por técnica proteómica (MALDI-TOF MS) e identidades discrepantes confirmadas por genómica (ITS)

EspecieAPI (n)  MALDI-TOF MS (n)  SCORE (rango)  Identidades discrepantes con MALDI-TOF MS  ITS 
Complejo
C. parapsilosis 
C. parapsilosis sensu stricto  29  24  1,725-2,176  3C. guilliermondii  3C. guilliermondii 
  C. orthopsilosis    1,795-1,901     
Complejo
C. glabrata 
C. glabrata sensu stricto  35  28  1,89-2,321  2C. guilliermondii
2C. parapsilosis
1C. lusitaniae 
2C. guilliermondii
2C. parapsilosis
1C. lusitaniae 
  C. bracariensis    2.159     
  C. nivariensis    2.101     
C. krusei    25  24  1,982-2,424  1 Magnusiomyces capitatus  1 Magnusiomyces capitatus 
C. tropicalis    45  43  1,707-2,282  1 Lodderomyces elongisporus
1C. lusitaniae 
1 Lodderomyces elongisporus
1C. lusitaniae 
C. guilliermondii    30  27  1,643-2,263  2C. parapsilosis
1C. lusitaniae 
2C. parapsilosis
1C. lusitaniae 
C. albicans    29  29  2,021-2,258     
C. dubliniensis    1,796-2,034  1C. albicans  1C. albicans 
C. kefyr    2.261     
C. lipolytica    1,96     
Total    201  186  1,643-2,424  186/201 (CS: 92.5%, K: 0.751)   

CS: porcentaje de concordancia directa; ITS: secuenciación de los espacios intergénicos; K: índice kappa; MALDI-TOF MS: matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Como ya ha sido publicado por otros autores, una limitación de los métodos convencionales es la incapacidad de identificar especies crípticas de los complejos C. parapsilosis y C. glabrata4,9,16. Por el contrario, MALDI-TOF MS permitió diferenciar entre especies del complejo C. parapsilosis, como Candida orthopsilosis y C. parapsilosis sensu stricto, y las del complejo C. glabrata, como Candida bracariensis, Candida nivariensis y C. glabrata sensu stricto. La identificación de las especies crípticas de estos complejos es importante no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino también por las posibles diferencias de sensibilidad a los antifúngicos y la virulencia de las especies que los integran9. Otro inconveniente que presentan los métodos convencionales es el de no poder diferenciar C. dubliniensis de C. albicans, cuya importancia radica en la diferente sensibilidad al fluconazol entre ambas especies9,15. En este trabajo, MALDI-TOF MS permitió identificar correctamente la levadura Magnusiomyces capitatus, erróneamente identificada por los métodos convencionales como C. krusei. Aunque M. capitatus es un hongo poco frecuente puede causar infecciones graves. Su identificación puede ser difícil y requerir mucho tiempo si no se cuenta con la tecnología MALDI-TOF MS2,7,11.

La dificultad para identificar C. guilliermondii por métodos fenotípicos es bien conocida. En el presente trabajo, 3 de los 30 aislamientos de C. guilliermondii estaban erróneamente identificados; algunos aislamientos identificados como C. parapsilosis (3) y C. glabrata (2) por métodos convencionales resultaron ser C. guilliermondii por MALDI-TOF MS y secuenciación3,9. Otra especie que presenta limitaciones con la metodología convencional es C. lusitaniae, que en este estudio fue identificada por los métodos convencionales como C. guilliermondii, C. tropicalis y complejo C. glabrata9. Un aislamiento identificado como C. tropicalis por el sistema API fue identificado por MALDI-TOF MS como Lodderomyces elongisporus, levadura a la que las últimas revisiones taxonómicas describen como una especie estrechamente relacionada con C. parapsilosis6. Los scores obtenidos por MALDI-TOF MS estuvieron comprendidos entre 1,643 y 2,424. C. guilliermondii fue la especie con scores más bajos: en 7 aislamientos de esta especie se requirió extracción en tubo y solo en un caso de estos no se llegó al score de identificación aceptable. La extracción en tubo se realizó solo en 8 ocasiones (7C. guilliermondii y 1C. tropicalis).

Estos resultados permiten concluir que las metodologías convencionales siguen siendo útiles para identificar en forma confiable las especies más frecuentemente aisladas de muestras clínicas, pero cuando se trata de especies de Candida poco comunes o raras, o especies crípticas, es importante su confirmación utilizando tecnologías como MALDI-TOF MS.

Bibliografía
[1]
O. Bader, M. Weig, L. Taverne-Ghadwal, R. Lugert, U. Gross, M. Kuhns.
Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.
Clin Microbiol Infect., 17 (2011), pp. 1359-1365
[2]
G. Brunetti, V. Visconti, M.C. Ghezzi, S. Mantovani, G. Ferretti, G. Raponi.
Management and treatment of Magnusiomyces capitatus (Geotrichum capitatum) pleural infection in a non-neutropenic patient with posaconazole. A new therapeutic opportunity?.
New Microbiol., 39 (2016), pp. 307-309
[3]
M. Castanheira, L.N. Woosley, D.J. Diekema, R.N. Jones, M.A. Pfaller.
Candida guilliermondii and other species of candida misidentified as Candida famata: Assessment by vitek 2 DNA sequencing analysis, and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in 2global antifungal surveillance programs.
J Clin Microbiol., 51 (2013), pp. 117-124
[4]
G. Criseo, F. Scordino, O. Romeo.
Current methods for identifying clinically important cryptic Candida species.
J Microbiol Methods., 111 (2015), pp. 50-56
[5]
M. Cuenca-Estrella.
Antifungal agents in the treatment of systemic infections: Relevance of mechanism of action, activity profile and resistances.
Rev Esp Quimioter., 23 (2010), pp. 169-176
[6]
E. De Carolis, L.A. Hensgens, A. Vella, B. Posterano, M. Sanguinetti, S. Senesi, et al.
Identification and typing of the Candida parapsilosis complex: MALDI-TOF MS vs.
AFLP. Med Mycol., 52 (2014), pp. 123-130
[7]
M. Desnos-Ollivier, C. Blanc, D. Garcia-Hermoso, D. Hoinard, A. Alanio, F. Dromer.
Misidentification of Saprochaete clavata as Magnusiomyces capitatus in clinical isolates: Utility of internal transcribed spacer sequencing and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and importance of reliable databases.
J Clin Microbiol., 52 (2014), pp. 2196-2198
[8]
J.L. Fleiss, B. Levin, M. Cho Paik.
Statistical methods for rates and proportions.
John Wiley & Sons, Inc, (2003),
[9]
F. Galán, L. García-Agudo, I. Guerrero, P. Marín, A. García-Tapia, P. García-Martos, et al.
Evaluación de la espectrometría de masas en la identificación de levaduras de interés clínico.
Enferm Infecc Microbiol Clin., 33 (2015), pp. 372-378
[10]
E. Jordana-Lluch, E. Martró Català, V. Ausina Ruiz.
La espectrometría de masas en el laboratorio de microbiología clínica.
Enferm Infecc Microbiol Clin., 30 (2012), pp. 635-644
[11]
A. Kolecka, K. Khayhan, M. Groenewald, B. Theelen, M. Arabatzis, A. Velegraki, et al.
Identification of medically relevant species of arthroconidial yeasts by use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.
J Clin Microbiol., 51 (2013), pp. 2491-2500
[12]
L. López Moral, I.N. Tiraboschi, M. Schijman, M. Bianchi, L. Guelfand, S. Cataldi.
Fungemias en hospitales de la Ciudad de Buenos Aires Argentina.
Rev Iberoam Micol., 29 (2012), pp. 144-149
[13]
G. Pineda, K. Scollo, G. Santiso, E. Lehmann, A. Arechavala.
Aislamientos de Candida dubliniensis en distintos materiales clínicos. Análisis de métodos fenotípicos de diferenciación con Candida albicans.
Rev Argent Microbiol., 40 (2008), pp. 211-217
[14]
M.S. Relloso, J. Nievas, S. Fares Taie, V. Farquharson, M.T. Mujica, V. Romano, et al.
Evaluación de la espectrometría de masas: MALDI-TOF. M.S. para la identificación rápida y confiable de levaduras.
Rev Argent Microbiol., 47 (2015), pp. 103-107
[15]
A.L. Roberts, A. Alelew, P.C. Iwen.
Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry to differentiate between Candida albicans and Candida dubliniensis.
Diagn Microbiol Infect Dis., 85 (2016), pp. 73-76
[16]
F.S. Rosenvinge, E. Dzajic, E. Knudsen, S. Malig, L.B. Andersen, A. Lovig, et al.
Performance of matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry for identification of clinical yeast isolates.
Mycoses., 56 (2013), pp. 229-235
[17]
G.A. Silva, L.T. Bernardi, P.D. Carvalho, M. Menegotto, P. Valente.
Rapid yeast DNA extraction by boiling and freeze-thawing without using chemical reagents and DNA purification.
Braz Arch Biol Technol., 55 (2012), pp. 319-327

Los componentes del grupo están relacionados en el anexo 1.

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