CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS RECEPTORES NUCLEARES PPAR
Las hormonas esteroides controlan el desarrollo embrionario y los procesos homeostáticos en los organismos adultos. Este control lo ejercen mayoritariamente a través de la modificación de los valores de expresión de numerosos genes, mediante la interacción específica con factores de transcripción activables. De forma general, un gran número de compuestos de naturaleza lipófila, ya sean esteroides o no, son capaces de modificar la expresión génica de la célula por interacción con factores de transcripción dependientes de ligando, agrupados en lo que se conoce, de forma genérica, como la superfamilia de los receptores nucleares. Este tipo de receptores intracelulares presentan una gran antigüedad, apareciendo en los seres vivos antes de la divergencia de vertebrados e invertebrados, conociéndose en la actualidad más de 150 proteínas diferentes integradas en este grupo.
Todos los receptores nucleares agrupados en esta superfamilia participan de una serie de características estructurales comunes1,2, presentando:
1. Una zona de unión al ADN (DBD, DNA binding domain), localizada aproximadamente en la parte central de la molécula receptora. Esta zona es la que proporciona la especificidad de unión del receptor a zonas determinadas del promotor de los genes diana, denominadas elementos de respuesta hormonal (HRE). Esta zona es la que presenta una mayor homología entre todos los receptores nucleares conocidos y está compuesta por dos estructuras típicas, los denominados "dedos de zinc" (zinc fingers). Estas estructuras contienen secuencias de aminoácidos capaces de interaccionar con átomos de zinc y adoptar una conformación espacial de tipo helicoidal, capaz de reconocer y adaptarse físicamente a secuencias específicas de ADN, lo que permite la únión entre el receptor y el HRE.
2. Una zona de unión al ligando (LBD, ligand binding domain), en la zona C-terminal de la proteína receptora. Se puede definir esta zona como un interruptor molecular, de manera que en presencia de la molécula de ligando transforma al receptor de una forma transcripcionalmente inactiva a otra capaz de activar la maquinaria de transcripción celular. La zona de LBD presenta una mayor variabilidad que la zona de DBD. En la porción final de este extremo C-terminal se encuentra una secuencia de transactivación, la AF2, dependiente de ligando y capaz de interaccionar con factores de coactivación necesarios para poner en marcha la maquinaria de traducción génica. Al menos en el caso de los receptores a las hormonas esteroides, esta zona AF2 parece necesaria para la unión de cofactores activadores que interrelacionan el receptor hormonal con la maquinaria básica de transcripción celular (TFIID, B, etc. y ARN polimerasa II) asociada a la caja TATA. Igualmente, en esta zona, así como en zonas adyacentes o superpuestas al DBD, se encuentran las secuencias causantes de la dimerización entre los diversos receptores nucleares.
3. Una zona N-terminal, de gran variabilidad. Esta zona contiene una secuencia, denominada AF1, que posee capacidad intrínseca (independiente de ligando) de transactivación.
En el campo que nos interesa, los receptores PPAR, o receptores activados por proliferadores peroxisómicos, se clasifican dentro de la subfamilia de receptores nucleares de clase II3. En este grupo se encuentran receptores a hormonas clásicas, como las hormonas tiroideas (TR) y la vitamina D (VDR), y receptores considerados hasta hace pocos años como receptores huérfanos, como es el caso de los receptores a los derivados de la vitamina A, los ácidos transretinoicos (RAR), receptores activados por oxisteroles (LXR) y receptores activados por ácidos biliares (FRX). La gran mayoría de estos receptores controlan el metabolismo de ácidos grasos y colesterol, y se caracterizan por poseer una serie de rasgos comunes:
1. Siempre actúan en forma de heterodímeros con el receptor al ácido 9cis-retinoico (RXR)4, uniéndose siempre el RXR en la zona 5' del HRE. Normalmente, cuando el RXR forma parte de un heterodímero, pierde su capacidad de activación de la transcripción, excepto en el caso del heterodímero con PPAR, en el que se produce una potenciación de la transcripción en presencia conjunta de agonistas para el RXR y PPAR.
2. La mínima zona de consenso para el HRE es la secuencia 5'-aggtca-3', presentada en la denominada "norma 1-5", que implica que esta secuencia se presenta en forma de una repetición directa separada por uno (PPAR), dos (RXR), tres (VDR), cuatro (TR, LXR) o 5 (RAR) nucleótidos. Esta situación es la más común, aunque pueden encontrarse repeticiones invertidas (FXR) o incluso evertidas.
3. Los PPAR, además de heterodimerizar con el receptor RXR, interaccionan con otras proteínas denominadas cofactores de expresión, los denominados correpresores y coactivadores de expresión5,6. Entre los factores correpresores, los más comunes son las proteínas SMRT (silent mediator for RARs and TRs) y N-CoR (nuclear receptor corepresor). Estos correpresores interaccionan con el receptor libre, con lo que inhiben la actividad transcripcional basal del receptor. La unión con el ligando específico induce la disociación del correpresor. Por el contrario, los coactivadores facilitan la interacción entre la zona AF2 del PPAR y la maquinaria de transcripción, una vez que se ha producido la activación del PPAR por unión a su ligando específico; las proteínas SCR-1 (steroid receptor coactivator-1)7 y p3008 se han identificado como coactivadores de los PPAR.
Independientemente de la activación típica por ligando, existen evidencias de que los PPAR pueden ser activados por otros mecanismos alternativos. Existen datos sobre la posible modulación de la actividad PPAR mediante procesos de fosforilación/defosforilación, aunque son bastante contradictorios. Por ejemplo, la fosforilación de los PPAR por acción de cinasas tipo MAP puede conducir a un incremento o a una reducción de la actividad transcripcional de los PPAR, dependiendo del tipo de señal fisiológica que origina el estímulo9,10.
Tipos, localización y ligandos de los PPAR
En la actualidad se han identificado tres genes que codifican receptores nucleares de tipo PPAR, de los cuales se han aislado 3 tipos o isoformas diferentes: PPAR*, PPARß (también denominado PPAR*, FFAR o NUCI) y PPAR*. De hecho, la utilización de zonas alternativas en el promotor del gen ppar* lleva a la aparición de dos subtipos de PPAR*: PPAR*1 y PPAR*211.
El PPAR* se expresa mayoritariamente en el hígado y, en menor medida, en el corazón, riñón, músculo esquelético e intestino; en el caso particular de la rata, también se encuentra abundantemente en el tejido adiposo marrón11,12. En todos estos tejidos, el PPAR* se halla directamente implicado en el control de la expresión de genes que codifican proteínas y enzimas clave en el metabolismo energético, especialmente en el catabolismo de los ácidos grasos. El PPAR* se expresa básicamente en el tejido adiposo, tanto en el de tipo marrón como blanco, así como en las células progenitoras de la médula ósea; en menor medida se localiza también en la musculatura estriada11,12. El PPAR* controla la expresión de genes implicados en la diferenciación celular (de adipocitos y líneas celulares sanguíneas), así como en el control de la utilización metabólica de la glucosa; su activación potencia los efectos de la insulina, disminuyendo la resistencia hística a la acción de esta hormona. Al menos en el ser humano, el subtipo PPAR*2 parece ser el causante del control de la diferenciación adipocitaria, estando incrementada su expresión en el tejido adiposo de personas obesas13. El PPARß es la isoforma de PPAR sobre la que po seemos menos información. Se encuentra ampliamente distribuido en el organismo12, especialmente en el músculo esquelético, placenta, intestino y cerebro, donde es la isoforma de PPAR predominante14. Su papel fisiológico es prácticamente desconocido, aunque en fechas recientes se ha descrito la participación del PPARß en la regulación de la expresión de genes que codifican proteínas implicadas en el metabolismo lipídico, como la acil-CoA sintetasa cerebral15 y la UCP3 en miocitos16.
Hoy día conocemos diversos ligandos endógenos de los PPAR; todos ellos son ácidos grasos o derivados metabólicos de éstos. Todos los ácidos grasos poliinsaturados se comportan como ligandos del PPAR a concentraciones fisiológicas, presentando, en general, una mayor afinidad para la isoforma PPAR*. Como excepción a esta regla, se encuentra el ácido erúcico (C22:1), que presenta una mayor selectividad por la isoforma humana del PPARß17. Entre los productos del metabolismo de los ácidos grasos cabe destacar un derivado de la PGJ2, la 15-deoxi-12,14-PGJ2, que se comporta como un ligando selectivo de la isoforma PPAR*18, así como el leucotrieno B4 y el ácido 8(S)-HETE, que se comportan como ligandos selectivos de la isoforma PPAR*19. Como ligandos sintéticos cabe destacar el ácido ETYA y los fibratos hipolipemiantes (clofibrato, bezafibrato, gemfibrozilo, Wy-14.643, etc.) como ligandos selectivos del PPAR*; las tiazolidindionas hipoglucemiantes (troglitazona, rosiglitazona, pioglitazona, etc.), como ligandos selectivos del PPAR*, y el ácido *-bromopalmítico y ciertos derivados de la estructura básica del ácido fíbrico como ligandos selectivos de la isoforma PPARß11,20.
PPAR Y ATEROSCLEROSIS
Tanto el PPAR* como el PPAR* se expresan en células endoteliales, células musculares lisas y macrófagos21-23. Igualmente, se ha detectado la presencia de ambas isoformas en aproximadamente el 60% de las placas ateroscleróticas presentes en arterias coronarias y carótidas humanas24. Hoy día sabemos que el efecto hipolipemiante de los fibratos se debe a la activación del PPAR*25. Sin embargo, la acción protectora de los fibratos frente a la aterosclerosis no sólo depende del efecto hipolipemiante, ya que estudios de intervención con fibratos (BECAIT, LOCAT, etc.) son capaces de evidenciar un enlentecimiento de la progresión de la aterosclerosis coronaria producido por la administración de fibratos, en ausencia de un efecto hipolipemiante significativo26,27. En consecuencia, en la actualidad se acepta que la activación de las diversas isoformas del PPAR en distintos territorios orgánicos, a través de la administración de fármacos que actúen como ligandos de estos receptores, puede modificar positivamente diversos procesos fisiopatológicos que favorecen el desarrollo de la aterosclerosis. Entre ellos encontraremos no sólo factores de riesgo clásicos, como las concentraciones plasmáticas de lípidos, la obesidad o la diabetes, sino también fenómenos como la alteración oxidativa de los lípidos circulantes o la inflamación crónica de la pared arterial, determinantes en la aparición y progresión de la placa aterosclerótica.
PPAR y metabolismo de los ácidos grasos
Metabolismo intracelular
Los PPAR regulan la mayoría de los procesos intracelulares causantes del metabolismo de los ácidos grasos. Como ya se ha descrito, el PPAR* se expresa principalmente en tejidos que poseen una alta capacidad para metabolizar ácidos grasos, donde regula genes implicados en el transporte de los ácidos grasos a través de la membrana celular, en la activación a derivados acil-CoA, en la entrada a la mitocondria, en la degradación de los ácidos grasos a través del proceso de ß-oxidación, ya sea en las mitocondrias o en los peroxisomas, y en la síntesis de cuerpos cetónicos.
El metabolismo hepático de los ácidos grasos se inicia con su transporte a través de la membrana celular, donde intervienen transportadores como la proteína transportadora de ácidos grasos (FATP, fatty acid transporter protein) y la translocasa de ácidos grasos (FAT, fatty acid translocase) (fig. 1). Posteriormente estos ácidos grasos son activados a su forma acil-CoA mediante la acción de la acil-CoA sintetasa (ACS). El PPAR* controla ambos procesos, ya que es capaz de inducir la expresión de todos estos genes, favoreciendo tanto el transporte como la activación de los ácidos grasos. Una vez en su forma activa, los ácidos grasos pueden incorporarse a los triglicéridos (vía anabólica) o bien ser oxidados (vía catabólica) a través del proceso de ß-oxidación en las mitocondrias o en los peroxisomas.
ß-oxidación peroxisómica y mitocondrial de ácidos grasos. El fenómeno de la proliferación peroxisómica, que aparece en roedores pero no en la especie humana, se caracteriza por un incremento del número y del volumen de peroxisomas, así como de la actividad de ß-oxidación peroxisómica de ácidos grasos. Este fenómeno aparece cuando se expone a los roedores a una dieta rica en grasas, al frío, a un tratamiento con hormonas tiroideas o a una serie de compuestos, denominados proliferadores peroxisómicos, entre los que se incluyen ciertos fármacos hipolipemiantes, y cuyo nombre se empleó para designar a estos receptores. El proceso de ß-oxidación peroxisómica consiste en la eliminación de dos átomos de carbono de los ácidos grasos mediante una serie de reacciones enzimáticas sucesivas para formar acetil-CoA, que posteriormente puede ser convertida en acetilcarnitina, acetato y acetoacetil-CoA. Los primeros genes diana del PPAR* descubiertos fueron precisamente aquellos que codifican para las enzimas que llevan a cabo la ß-oxidación peroxisómica de los ácidos grasos. Entre estos se encuentra, la acil-CoA oxidasa (ACO), la enzima limitante de esta vía enzimática de destrucción de ácidos grasos, la enoil-CoA hidratasa/deshidrogenasa enzima multifuncional (EM) y la ceto-acetil-CoA tiolasa28-31 (fig. 1). Todos estos genes contienen un PPRE en su promotor y su transcripción se encuentra bajo el control del PPAR*. La activación mediada por PPAR* del proceso de ß-oxidación peroxisómica cumple dos funciones básicas. Por un lado, reduce las cadenas de ácidos grasos de larga cadena (C > 20) procedentes principalmente de la dieta, generando ácidos grasos de cadena más corta, que posteriormente son degradados en la mitocondria. Por otro lado, este proceso también oxida eicosanoides y xenobióticos, contribuyendo a la destoxificación de moléculas endógenas y exógenas. A pesar de todo, la ß-oxidación peroxisómica representa aproximadamente un 20-25% de la ß-oxidación de ácidos grasos que se produce en la célula. La mitocondria es el orgánulo intracelular que más contribuye a la ß-oxidación de los ácidos grasos, generando energía en forma de ATP gracias a la fosforilación oxidativa. Además, esta ß-oxidación mitocondrial es el doble de eficiente desde el punto de vista energético, ya que los peroxisomas producen un 30% menos de ATP y un 30-40% más de calor32. El primer paso que conduce a la ß-oxidación mitocondrial implica la participación de un sistema de transporte facilitado carnitina-dependiente de los ácidos grasos hacia el interior de la mitocondria. Este sistema está integrado por varias enzimas, en una de las cuales, la carnitina palmitoil transferasa I (CPT-I), se ha descrito la presencia de un PPRE en su promotor33. Además, el PPAR* también regula la transcripción de aquellos genes implicados directamente en el proceso de ß-oxidación mitocondrial como es el caso de la acil-CoA deshidrogenasa de cadena intermedia (MCAD)34. Cada ciclo de ß-oxidación mitocondrial genera una molécula de acetil-CoA que posteriormente puede servir como sustrato para iniciar diferentes procesos. Esta molécula de acetil-CoA puede condensarse con otra de oxaloacetato para formar citrato, que puede entrar en el ciclo del ácido cítrico, donde se oxida generando CO2 y ATP, o puede ser exportada al citosol para sintetizar ácidos grasos. En condiciones de bajas concentraciones de oxalacetato, como aparecen en el ayuno o en pacientes con diabetes, una gran parte del acetil-CoA es convertida en cuerpos cetónicos, que sirven de sustrato energético para tejidos como el músculo esquelético, corazón, córtex renal y, sobre todo, el cerebro, órgano para el cual constituye la única fuente de energía no derivada de la glucosa. La hidroximetilglutaril-CoA sintetasa mitocondrial (HMG) es la principal enzima implicada en la síntesis de los cuerpos cetónicos y está controlada directamente por PPAR*35.
La prueba definitiva de que PPAR* regula todos estos procesos del metabolismo de los ácidos grasos llegó con la creación de ratones transgénicos que carecen del receptor PPAR* (knock-out). En efecto, en estos ratones la administración de activadores del PPAR* no incrementaba la ß-oxidación mitocondrial ni la peroxisómica, confirmando que la inducción de estos procesos era mediada por PPAR*36.
*-oxidación microsomal de ácidos grasos. Otro de los procesos intracelulares regulados por PPAR* es la *-oxidación microsomal, un sistema que desempeña un papel fundamental en la oxidación de una gran variedad de compuestos endógenos y exógenos. Dentro de este sistema participan los CYP4A, un grupo de enzimas de la superfamilia del citocromo P-450. Estas enzimas catalizan la *-hidroxilación de ácidos grasos y ecosanoides y son inducidas por fibratos y por proliferadores peroxisómicos en el hígado y riñón. Dos de estos genes, CYP4A1 y CYP4A6, poseen un PPRE funcional en la secuencia de su promotor y responden in vivo y en sistemas celulares a agonistas del PPAR*37-39. En consecuencia, el receptor PPAR* puede desempeñar un papel clave en los procesos de destoxificación de xenobióticos.
PPAR* y adipogénesis. Los elevados valores de expresión de PPAR* en el tejido adiposo40 indicaban un papel de este factor de transcripción en la adipogénesis, puesto que en líneas celulares de preadipocitos tan sólo aparecen trazas de PPAR*. La aparición de PPAR* durante el proceso de diferenciación adipocitaria precede a la de marcadores tardíos de la diferenciación, tales como la aP2 (adipocyte fatty acid binding protein) y el C/EBP* (CAAT/enhancer binding protein). Una nueva prueba del papel de PPAR* en la adipogénesis se consiguió al forzar su expresión en fibroblastos NIH-3T3, los cuales en presencia de activadores de PPAR* se convirtieron en adipocitos y acumularon lípidos40. Esta diferenciación adipocitaria de fibroblastos o de células progenitoras (durante el desarrollo de los tejidos) en adipocitos va acompañada de la inducción de varios marcadores de la diferenciación adipocitaria, muchos de los cuales se encuentran bajo control directo de PPAR*. Dentro de este grupo de genes se halla la lipoproteinlipasa (LPL)41, liberada por los adipocitos y que hidroliza los ácidos grasos de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, very low density lipoproteins) circulantes. Otros genes regulados por PPAR* son FAT y FATP42,43, la aP2, que transporta ácidos grasos en el citoplasma de los adipocitos, o la ACS. Todos ellos contienen PPRE funcionales en su promotor y pueden ser inducidos por PPAR*44,45. Este factor de transcripción también favorece la síntesis de ácidos grasos y de triglicéridos en los adipocitos, ya que es capaz de inducir la expresión de genes como la enzima málica46,47, que favorece la lipogénesis, y la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK)48, implicada en la producción de glicerol para almacenar los ácidos grasos en forma de triglicéridos. En resumen, PPAR* induce una serie de genes que provocan una conversión fenotípica de los fibroblastos o células progenitoras en células que acumulan lípidos. Como se describirá posteriormente, la activación de estos procesos en los adipocitos por las tiazolidindionas, agonistas del receptor PPAR* que se utilizan como antidiabéticos, se considera el mecanismo principal por el cual estos fármacos mejoran la sensibilidad a la insulina en pacientes con diabetes mellitus no dependiente de insulina.
Metabolismo extracelular
El papel de los PPAR en el metabolismo extracelular de los ácidos grasos es un reflejo de los efectos terapéuticos de los fibratos, el primer grupo de fármacos utilizados como hipolipemiantes. Estos fármacos se emplean en clínica por su capacidad para disminuir los valores de triglicéridos e incrementar las concentraciones de colesterol HDL49. El subtipo PPAR* es el causante de las acciones de los fibratos sobre los valores de colesterol HDL gracias a su capacidad para inducir la transcripción de las principales apolipoproteínas de las HDL en humanos, la apolipoproteína A-I y la apolipoproteína A-II. El efecto de los fibratos sobre las concentraciones de triglicéridos, que son mayoritariamente transportados por las VLDL, se debe a dos acciones. Por un lado, los fibratos, a través de PPAR*, incrementan la lipólisis de las VLDL porque aumentan directamente la actividad de la LPL al incrementar su expresión. Además, estos fármacos hipolipemiantes reducen la expresión del gen apo-C-III49, una apolipoproteína que inhibe la actividad LPL y reduce la captación por el hígado de las VLDL. Por otra parte, los fibratos también incrementan la captación y la degradación de ácidos grasos a través del proceso de ß-oxidación mitocondrial, acciones que, unidas a la reducción de la síntesis de ácidos grasos y triglicéridos, provocan un descenso de la producción de VLDL por el hígado49. La utilización de ratones deficientes en PPAR* demostró de forma inequívoca que las acciones de los fibratos sobre los valores plasmáticos de triglicéridos y HDL eran mediadas por PPAR*50,51. Las tiazolidindionas, activadores del receptor PPAP*, también reducen las cifras circulantes de triglicéridos, pero en este caso, al contrario de lo que ocurre con los fibratos, esta reducción se debe a un incremento de la actividad LPL del tejido adiposo, lo que provoca un incremento del catabolismo de los triglicéridos52. La combinación de fibratos y tiazolidindionas produce una reducción de los triglicéridos plasmáticos más pronunciada que cada uno de estos fármacos por separado, lo que indica que futuros fármacos capaces de activar PPAR* y PPAR* a la vez resultarían más eficaces para reducir las concentraciones plasmáticas de triglicéridos53.
PPAR, resistencia a la insulina y metabolismo energético
Dado el papel de los PPAR en el metabolismo celular, se han realizado numerosos esfuerzos para identificar ligandos específicos de estos receptores con aplicación clínica. Una de las áreas más productivas de investigación farmacológica fue el descubrimiento de unos nuevos antidiabéticos, las tiazolidindionas. Estos fármacos (troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, ciglitazona, etc.) incrementan la sensibilidad a la insulina gracias a su capacidad para activar el subtipo PPAR*54,55. Parece poco probable que las tiazolidindionas lleven a cabo sus acciones sobre el metabolismo de la glucosa por activación del PPAR* en el músculo, ya que las cifras de este receptor en este tejido son muy bajas56. Esto implica que el efecto de las tiazolidindionas sobre la sensibilidad a la insulina debe ser consecuencia de un efecto indirecto, seguramente mediado por las acciones del PPAR* en el tejido adiposo. La importancia del tejido adiposo en el metabolismo de la glucosa se basa en la observación clínica de que tanto una atrofia de tejido adiposo como la obesidad van acompañadas de resistencia a la insulina55. Esto supone que es necesaria una cantidad normal de tejido adiposo para conseguir una sensibilidad normal a la insulina, mientras que tanto una deficiencia como un exceso de tejido adiposo incrementarían la resistencia a la insulina. Actualmente se considera que los efectos beneficiosos de la activación del PPAR* sobre la homeostasia de la glucosa son debidos a la inducción de ciertas señales metabólicas en el tejido adiposo, que indirectamente causarían una mejora en la sensibilidad a la insulina.
Se conocen dos grupos de mediadores producidos por el tejido adiposo que afectan al metabolismo de la glucosa en el músculo esquelético. El primer grupo lo forman proteínas sintetizadas por los adipocitos, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF*)57 y la leptina58, que interaccionan con las acciones de la insulina. El segundo grupo está formado por mediadores lipídicos, como los ácidos grasos libres (AGL), que también son determinantes fundamentales de la sensibilidad del músculo a la insulina55.
El TNF* y la leptina son considerados adipostatos, ya que su síntesis y regulación se correlaciona con el incremento del tamaño de los depósitos de grasa59. Respecto al TNF*, el aumento de sus valores plasmáticos en la obesidad provoca un aumento de la lipólisis en los adipocitos, provocando un incremento de las concentraciones circulantes de AGL, mientras que, por otro lado, reduce la actividad LPL, lo que disminuye la recaptación de ácidos grasos. En esta situación de aumento de las cifras de TNF*, también se observa un incremento de la glucemia, debido a la reducción de la expresión de GLUT4, un transportador de glucosa dependiente de insulina, que desempeña un papel fundamental en la homeostasia de la glucosa60. Por otra parte, el TNF* reduce además las acciones de la insulina por alteración de sus sistemas de transducción de la señal61. Todos estos efectos del TNF* que favorecen la aparición de resistencia a la insulina son contrarrestados por las tiazolidindionas, ya que la activación del PPAR* provoca una disminución de la expresión de TNF* y de las acciones mediadas por esta citocina.
En cuanto a la leptina, el producto del gen ob, es una proteína secretada por los adipocitos que actúa como indicador del tamaño de los depósitos de energía en el tejido adiposo62. La unión de la leptina a sus receptores hipotalámicos provoca un descenso de la ingestión de alimentos y un aumento del gasto energético63. También existen receptores para la leptina en localizaciones periféricas. En concreto, en los adipocitos la leptina estimula la lipólisis y la utilización de glucosa, mientras que en las células ß del páncreas reduce la expresión y la secreción de insulina. Estos efectos de la leptina son compensados por la activación del PPAR*, capaz de inhibir la expresión de esta hormona64.
Los AGL son mediadores lipídicos que también están implicados en la aparición de resistencia a la insulina. Estos AGL son liberados de los adipocitos por acción de la lipasa sensible a las hormonas (HSL) y también se forman durante la lipólisis de las VLDL por la LPL. Al igual que en el hígado, en el tejido adiposo y en el músculo los AGL entran gracias a la acción de transportadores específicos de ácidos grasos (FATP y FAT) y, una vez dentro de las células, son activados por acción de la acil-CoA sintetosa. Las tiazolindindionas incrementan la expresión de muchos de estos genes (p. ej., la FATP, ACS y LPL) en el tejido adiposo, lo que incrementa la recaptación de ácidos grasos, mejorando la sensibilidad a la insulina en el músculo. Por tanto, el tratamiento con activadores del PPAR* desvía los AGL hacia los adipocitos, un efecto corroborado por la inducción de hipertrofia e hiperplasia de los adipocitos y aumento de peso en roedores tratados con tiazolidindionas64. Debido a los bajos valores de PPAR* presentes en el músculo, los agonistas del PPAR* no afectan a la expresión de ninguno de los genes mencionados en este tejido. En definitiva, la captación de AGL disminuye en el músculo en favor de una mayor captación en el tejido adiposo. Esta menor captación de AGL en el músculo favorece la sensibilidad a la insulina, según el ciclo de Randle65. Por otra parte, la activación de PPAR* también incrementa la expresión de GLUT4, lo que favorece la reducción de la glucemia.
Como consecuencia de las acciones que acabamos de comentar, las tiazolidindionas mejoran la sensibilidad a la insulina, incrementan el metabolismo de la glucosa y reducen las concentraciones plasmáticas de triglicéridos66.
A pesar de todo, han aparecido una serie de datos que dificultan el entendimiento del mecanismo de acción de las tiazolidindionas, mediada por la activación del PPAR* en el tejido adiposo. Por un lado, se han generado ratones transgénicos aP2/DTA, que prácticamente carecen de tejido adiposo, eliminado por expresión en este tejido de la toxina A de la difteria67. Estos ratones tienen cifras muy bajas de leptina y muestran hiperfagia, pero no presentan un exceso de peso. Sometidos a una dieta estándar, presentaban hiperlipemia, hiperglucemia e hiperinsulinemia, características que determinan la presencia de resistencia a la insulina. A pesar de la ausencia de valores destacables de tejido adiposo, el tratamiento con tiazolidindionas normalizó los niveles de lípidos, glucosa e insulina. Estos resultados cuestionan que los efectos de las tiazolidindionas sean mediados únicamente por PPAR* y abren una puerta a la participación de otros mecanismos no relacionados con este receptor nuclear. Otro hallazgo sorprendente68 es que ratones heterocigotos deficientes en PPAR*(+/) presentan una mejor sensibilidad a la insulina que los ratones con valores normales de PPAR*. Estos resultados indican que, en contra de lo que se pensaba hasta ahora, aunque la activación farmacológica de PPAR* mejora la resistencia a la insulina, un efecto similar se consigue genéticamente por reducción de la expresión de este receptor.
El papel que desempeña el subtipo PPAR* en el metabolismo energético ha sido mucho menos estudiado, pero diversos resultados parecen implicarlo en el control tanto de la homeostasia de la glucosa como del peso corporal. Por ejemplo, los fibratos, especialmente bezafibrato y clofibrato, mejoran la tolerancia a la glucosa en pacientes diabéticos69-74 y en ratas75. Igualmente, los fibratos76,77, la deshidroepiandrosterona78, una hormona esteroide que activa PPAR*, y el ácido linoleico conjugado79, un potente activador de PPAR*, reducen los depósitos de grasa, lo que se traduce en una reducción del peso corporal en las ratas tratadas con estos compuestos. Estos resultados determinan un papel para el subtipo PPAR* en la homestasia de la energía, pa-pel que resultó confirmado por la observación de que los ratones deficientes en PPAR* (knock-out) desarrollan obesidad80. Los mecanismos moleculares a través de los cuales PPAR* afecta al metabolismo energético no se conocen por completo, pero se empiezan a vislumbrar varias posibilidades. Primero, los agonistas del PPAR* son capaces de activar la ß-oxidación peroxisómica en adipocitos, a pesar de los bajos valores de este receptor76. Como ya se ha descrito, el aumento de este sistema de destrucción de ácidos grasos produce un 30% menos de ATP y un 30-40% más de calor32 que la ß-oxidación mitocondrial, con lo que la destrucción de ácidos grasos y la ineficacia energética evitan, al menos en parte, la acumulación de ácidos grasos en el adipocito en forma de triglicéridos, un proceso que requiere energía.
Segundo, recientemente se ha descubierto que los agonistas de los PPAR inducen la expresión de las proteínas desacopladoras (UCP, uncoupling proteins). En las mitocondrias se produce la oxidación de los sustratos energéticos por la cadena de transporte electrónico, generándose un gradiente electroquímico de protones. Generalmente, este gradiente electroquímico se reduce al penetrar los protones en la mitocondria a través de la ATP-sintasa, formándose ATP. En consecuencia, la oxidación de los sustratos energéticos está acoplada a la síntesis de ATP. Las UCP son proteínas mitocondriales que reducen el gradiente electroquímico de protones, sin formar ATP y generando en su lugar calor. Se conoce la existencia de tres UCP. La primera en ser descubierta, la UCP-1, se encuentra únicamente en el tejido adiposo marrón, de poca trascendencia en la especie humana, ya que sólo se expresa en el período perinatal. En el año 1997 se descubrieron dos nuevas UCP, la UCP-2, abundante en todos los tejidos, y la UCP-3, presente en el tejido adiposo y, sobre todo, en el músculo esquelético81. Estas UCP se han relacionado con la obesidad y la diabetes mellitus no dependiente de insulina81. Los fibratos y otros activadores del PPAR* son capaces de provocar una ligera inducción ectópica de UCP-1 en el tejido adiposo blanco y también inducen la expresión de UCP-3 en el tejido adiposo blanco76 y en músculo76,82. Estas inducciones pueden reducir los valores de ATP disponibles para acumular ácidos grasos en los adipocitos en forma de triglicéridos.
Tercero, la activación del PPAR* reduce los títulos de TNF*, lo que puede contribuir a mejorar la sensibilidad a la insulina83.
Por último, PPAR* media la desdiferenciación inducida por leptina de adipocitos a células con gran capacidad para oxidar ácidos grasos, lo que lo convierte en un elemento clave para las acciones de esta hormona sobre el peso corporal84,85. En efecto, la inducción de hiperleptinemia en ratas normales disminuyó de forma muy acentuada los depósitos de grasa a través de la reducción de la expresión de enzimas lipogénicas y del factor de transcripción que las regula, PPAR*. Por otro lado, la hiperleptinemia también incrementó los títulos de enzimas implicadas en la oxidación de ácidos grasos (ACO, CPT-I, MCAD) y del receptor que las regula, PPAR*, así como de UCP-1 y UCP-2. Además, la transformación fenotípica de una célula que almacena lípidos (adipocito) a una célula que oxida ácidos grasos iba acompañada de la pérdida de marcadores adipocitarios, como aP2, TNF* y el gen ob, y por la expresión del gen Pref-1, un marcador de preadipocitos.
Oxidación lipídica e inflamación de la íntima arterial. Modulación por PPAR
Hoy día se acepta que la oxidación de los lípidos presentes en las lipoproteínas es uno de los factores determinantes del proceso aterosclerótico86. Los agonistas del receptor PPAR*, como los fibratos, presentan un efecto protector frente a los procesos oxidativos de doble naturaleza: incrementan de forma directa la expresión de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa87, e incrementan de forma indirecta la resistencia de las lipoproteínas plasmáticas a los procesos oxidativos88. Este último efecto se debe a un cambio en la composición de ácidos grasos de las lipoproteínas, con un incremento de los ácidos grasos monoinsaturados, resistentes a los procesos oxidativos, y un descenso proporcional del contenido en ácidos grasos poliinsaturados, más susceptibles a la oxidación88,89. Tanto en roedores como en la especie humana, la modificación en la composición de ácidos grasos se debe a un incremento de la expresión y actividad de la enzima responsable de la síntesis de los ácidos grasos monoinsaturados, la estearoil-CoA desaturasa90,91. Además del efecto que pueden ejercer los fibratos a través de la activación del PPAR*, se ha demostrado que la inducción y la activación del PPAR* por las LDL oxidadas es un componente clave en la formación de las células espumosas a partir de monocitos92. En el desarrollo la placa aterosclerótica, los monocitos migran al espacio subendotelial y rápidamente acumulan lípidos. Estos monocitos dan lugar a la formación de células espumosas cargadas de lípidos, características de la lesión aterosclerótica. Se ha demostrado que el tratamiento de monocitos con LDL oxidadas causa un incremento intenso en la expresión de PPAR*92. Además, la activación del PPAR* (probablemente por productos resultantes de la oxidación de ácidos grasos) aumentó la expresión del receptor scavenger CD36, que a la vez se asocia con una mayor recaptación de colesterol LDL. De hecho, el PPAR* regula el proceso de diferenciación de monocito a macrófago92.
Normalmente, la producción de especies oxidantes va asociada a la perpetuación de un proceso inflamatorio crónico; éste es el caso de la aterosclerosis, que se considera hoy día un proceso inflamatorio crónico de la pared arterial93. Un descubrimiento capital en el campo de los PPAR ha sido la demostración experimental de que la activación de las isoformas PPAR* y PPAR* por agonistas específicos (fibratos hipolipemiantes y tiazolidindionas hipoglucemiantes, respectivamente) comporta la aparición de un potente efecto antiinflamatorio19,24,94. Esta actividad antiinflamatoria de los agonistas del PPAR sería uno de los factores responsables del efecto antiaterosclerótico directo de estos fármacos, independiente de cualquier modificación de los lípidos plasmáticos. Por otra parte, se ha podido demostrar igualmente que fármacos antiinflamatorios no esteroides clásicos, como la indometacina o el ibuprofeno, se comportan como agonistas de los receptores PPAR* y PPAR* a las dosis comúnmente utilizadas en terapéutica95. Este descubrimiento explicaría el hecho, aparentemente paradójico, de que muchos antinflamatorios no estereoides sólo son efectivos en terapéutica a dosis superiores a las necesarias para inhibir la actividad ciclooxigenasa, aceptada tradicionalmente como la diana farmacológica de estos fármacos. Por otra parte, el hecho de que tanto la expresión del PPAR* como la del PPAR* se encuentren regulada por glucocorticoides96,97 indicaría que los PPAR forman parte de los mecanismos fisiológicos de control del fenómeno inflamatorio98. Tanto el PPAR* como el PPAR* manifiestan su actividad antiinflamatoria interfiriendo con los procesos de activación de factores de transcripción mediadores del proceso inflamatorio, en concreto los factores STAT1, AP-1 y, sobre todo, el factor NFkB23,99,100. En esplenocitos de ratones senescentes (15 meses de edad), aparece un estado de hiperactivación transcripcional del factor NFkB, que se debe a la reducción en los títulos de expresión del receptor PPAR*, atribuible al proceso de envejecimiento101. La administración de agonistas del PPAR* a estos ratones redujo significativamente la actividad constitutiva del factor NF*B, efecto que desaparecía cuando se realizaba el mismo tipo de experimento con ratones knockout PPAR* /, lo que demuestra el papel clave del PPAR* en el control de la actividad del factor NF*B.
PPAR y proliferación celular
La denominación de los PPAR deriva del hecho de ser activados por una serie de compuestos de estructura química diversa que se caracterizan por inducir, cuando se administran de forma crónica a ratas y ratones, la proliferación de peroxisomas en el tejido hepático102. Este fenómeno va asociado a la aparición de hipertrofia e hiperplasia hepática y, a largo plazo, hepatocarcinogénesis; de hecho, los proliferadores peroxisómicos se comportan como carcinógenos no genotóxicos103 en roedores. Este efecto, al igual que la gran mayoría de los efectos producidos por los proliferadores peroxisómicos en el organismo, se debe a la activación de los receptores PPAR, en concreto la isoforma *104 y, de hecho, todos los ligandos de PPAR* conocidos hasta el momento se comportan como proliferadores peroxisómicos. La activación del PPAR* por estos compuestos produce tres efectos que conllevan la aparición de carcinogénesis: incremento de la expresión de las enzimas constituyentes del sistema de ß-oxidación peroxisómica de ácidos grasos, con el consiguiente incremento de la producción de H2O2 y daño oxidativo al ADN, inhibición de la apoptosis e incremento de la proliferación hepatocitaria105. Si se tiene en cuenta la amplia utilización de los fibratos hipolipemiantes, que como ya se ha comentado se comportan como ligandos del PPAR*, en la terapéutica humana durante períodos de tiempo prolongados y con dosis elevadas, es evidente la trascendencia sanitaria que representaría el determinar de una forma clara si el fenómeno proliferativo y, por consiguiente, el riesgo carcinogénico están presentes en el humano. No es de extrañar que periódicamente se cree alarma social en la población ante comentarios periodísticos de artículos científicos que tratan este problema, como el aparecido en enero de 1996 en JAMA bajo el título "Carcinogenicidad de los fármacos hipolipemiantes"106, que mereció amplios comentarios en la prensa escrita y en las televisiones de nuestro país.
Los datos de que se dispone hasta el momento indican que la especie humana parece ser resistente al fenómeno de proliferación peroxisómica. De los cinco trabajos publicados en los que se estudia este fenómeno en pacientes tratados con fibratos, únicamente en dos se detecta un ligero incremento del número o bien del volumen peroxisómico de las biopsias estudiadas, resultados cuya relevancia, dada la alta variabilidad interindividual, cuestionan los propios investigadores107. Igualmente, la inmensa mayoría de estudios sobre proliferación realizados en cultivos primarios de hepatocitos humanos han proporcionado resultados negativos108. Paradójicamente, se ha podido identificar la presencia de PPAR* y RXR en los hepatocitos humanos109, así como PPRE presentes en las zonas promotoras de los genes humanos homólogos a aquellos que responden al fenómeno proliferativo en la rata o el ratón110; estudios de cotransfección utilizando construcciones quiméricas de PPAR* humano parecen indicar que éste es perfectamente funcional111. Por fortuna, en los dos últimos años ha aparecido una serie de datos experimentales que indican, de forma prácticamente concluyente, que en el ser humano no se produce el fenómeno de proliferación peroxisómica ni la hepatocarcinogénesis asociada al mismo. Estos datos pueden resumirse en los siguientes puntos: a) los títulos de expresión de la isoforma PPAR* en el hígado humano oscilan entre un 1 y un 10% de los encontrados en hígado de rata o ratón112; b) hasta un 40% de la proteína PPAR* presente en el hígado humano constituye una forma polimórfica sin actividad transcripcional113; c) la capacidad de unión a un PPRE específico de las formas de PPAR* activas en el hígado humano es, en comparación con el PPAR* de rata, entre tres y cuatro veces menor114 y, por último, d) datos no publicados obtenidos en nuestro laboratorio indican que la administración continuada durante 8 semanas de fibratos a dosis terapéuticas no incrementa la expresión de la acil-CoA oxidasa, enzima marcadora de la proliferación peroxisómica, en biopsias de pacientes tratados. Dado que las dosis de ligandos de PPAR* necesarias para producir el fenómeno de proliferación peroxisómica son muy superiores a las necesarias para inducir otros efectos mediados por PPAR*102, esta característica explicaría la efectividad terapéutica de los fibratos en la especie humana.
Antes de finalizar esta revisión sobre el papel metabólico de los PPAR, es preciso señalar que, respecto a los fenómenos de proliferación celular, la activación de la isoforma PPAR* posee un efecto diametralmente opuesto al descrito para el PPAR*, promoviendo la diferenciación celular y la detención del crecimiento celular, con lo que se interrumpe el ciclo celular11. Este fenómeno, que ya hemos descrito con detalle en el caso de la diferenciación adipocitaria, aparece en otros tipos celulares, entre ellos las células musculares lisas24, con la consiguiente trascendencia para el proceso aterosclerótico y, quizás más importante aún, en las células tumorales. Diversos estudios indican que las células tumorales de origen mamario o prostático presentan valores elevados de PPAR* y que, cuando se cultivan conjuntamente con ligandos del PPAR*, detienen su crecimiento115,116. Estos resultados abren una nueva perspectiva en la utilización terapéutica de los ligandos de PPAR, aunque no sin ciertas sombras, ya que existen igualmente datos que indican que los ligandos de PPAR* pueden, en determinadas situaciones, presentar el efecto opuesto, promoviendo el desarrollo tumoral117.
AGRADECIMIENTO
Los trabajos realizados en la Unidad de Farmacología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Barcelona han sido financiados por becas de la FPCNL, CICYT (SAF97-0215 y SAF00-0201) y FISS 00/1124. Igualmente agradecemos la financiación ofrecida por la Generalitat de Catalunya a través de las becas SGR96-84 y 1998SGR-33.