Un diagnóstico acertado en los pacientes infértiles es clave para determinar el tratamiento de elección en un programa de reproducción asistida. En el caso del varón, el diagnóstico inicial se basa en el resultado del seminograma, el cual permite hallar problemas relacionados con la esterilidad de la pareja, pero es insuficiente para la correcta detección de la infertilidad masculina, puesto que no predice la capacidad funcional de los espermatozoides. En los últimos años, han aparecido múltiples estudios que relacionan la integridad del ADN espermático con la fertilidad. Al mismo tiempo, los laboratorios de fecundación in vitro (FIV) tienen a su alcance nuevos métodos de selección del esperma, como los microfluidos, que ayudarían a disminuir el grado de fragmentación del ADN espermático (SDF) en la muestra. En este trabajo revisamos el impacto que tienen la SDF y el uso de los dispositivos de microfluidos en los resultados de FIV con base en una selección de estudios relevantes publicados hasta febrero de 2023.
An accurate diagnosis in infertile patients is key to determine the treatment of choice in an assisted reproduction program. In the case of the male, the initial diagnosis is based on the result of the semen analysis. The semen analysis can detect problems related to the couple's infertility, but it is insufficient for the correct diagnosis of male infertility, since it does not predict the functional capacity of the spermatozoa. In recent years, multiple studies have appeared that relate sperm ADN integrity to fertility. At the same time, IVF laboratories have within their reach new methods of sperm selection, such as microfluidics, which would make it possible to reduce the degree of ADN fragmentation in the sample. In this paper we review the impact of sperm ADN fragmentation and the use of microfluidic devices on IVF outcomes based on a selection of relevant studies published up to February 2023.
La esterilidad afecta a 15% de la población en edad fértil siendo el factor masculino la causa de la infertilidad en 50% de los casos1. El porcentaje de hombres con esta condición idiopática se sitúa alrededor de 40%2.
De acuerdo con los criterios establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS)3, el seminograma es la única herramienta válida actualmente para estimar la fertilidad del varón, pero tiene limitaciones en su aplicación clínica puesto que no refleja el potencial de fecundación de la muestra. Hasta 15% de los hombres que no logran tener descendencia presentan valores seminales dentro del rango de la normalidad4.
La falta de valor predictivo del seminograma ha llevado a la búsqueda de biomarcadores que complementen el análisis básico del semen y puedan emplearse como herramienta diagnóstica. Hasta el momento han sido publicados múltiples estudios sobre marcadores moleculares de la función espermática, pero ninguno de ellos ha sido suficientemente relevante como para ser empleado en el diagnóstico clínico de rutina. Ejemplos de esos señaladores, son la 8-oxoguanina como biomarcador del daño en el ADN del espermatozoide causado por los radicales libres, el contenido en colesterol en la membrana de este y la concentración de calcio intracelular como indicadores de morfología espermática y potencial de fecundación del esperma o el contenido en enzimas antioxidantes como marcadores de respuesta al estrés oxidativo del espermatozoide5–7.
Recientemente, ha sido la fragmentación del ADN espermático (SDF), su origen, papel en la etiología de la infertilidad masculina y su impacto en las técnicas de reproducción asistida (TRA), el marcador de funcionalidad espermática que ha adquirido mayor relevancia. Este interés ha ido de la mano del desarrollo de mejores métodos de diagnóstico de la SDF y de la aparición de nuevos procedimientos y dispositivos para la selección de espermatozoides libres de SDF.
En este artículo revisamos las publicaciones más recientes sobre el impacto de la SDF y el uso de los dispositivos basados en la tecnología de microfluidos en los hallazgos de fecundación in vitro (FIV) con el objetivo de esclarecer en qué situaciones estaría indicada la realización de una prueba de SDF y, en función del resultado, la utilización de los microfluidos.
Fragmentación del ADN e infertilidad masculinaEl daño en el ADN se define como cualquier lesión que afecta a la cromatina del espermatozoide; cuando nos referimos a las roturas que se producen en el ADN, hablamos de la fragmentación de este. La integridad del ADN es crucial para un correcto desarrollo del embrión, la implantación y la consecución de embarazo8,9.
Numerosos estudios han relacionado la SDF con la fertilidad masculina y el éxito reproductivo10,11 y, aunque no se conocen en profundidad los mecanismos moleculares implicados, parece clara la asociación entre determinadas condiciones correspondientes a estrés oxidativo y la SDF. Un ejemplo de estas son los tratamientos con agentes quimioterápicos12, patologías como el varicocele13 o el tabaquismo14. Szabó et al. revisan en una investigación reciente algunos de estos factores externos que contribuirían a la SDF del espermatozoide vía estrés oxidativo15.
Los niveles de SDF son superiores en los hombres infértiles. Mientras que en los fértiles se ha descrito que alrededor de 10% de los espermatozoides del eyaculado poseen grados medibles de daño en el ADN, las tasas de SDF en usuarios infértiles llegan a 25%16. Una revisión de Santi et al., en la que se analizan los niveles de SDF encontrados en más de 4.000 varones fértiles e infértiles (27 estudios), reveló que la diferencia media en las tasas de SDF entre hombres de ambas condiciones fue de 1,6%, y el valor de SDF que mejor discriminaba entre aquellos fértiles e infértiles fue de 20%17. Otro dato relevante es que entre 40-50% de los hombres con esterilidad idiopática tienen valores elevados de SDF8.
La SDF puede afectar a una o a las dos cadenas del ADN. Las roturas de cadena simple (SSB) se producen en todas las regiones del genoma, mientras que las de doble cadena (DSB) se localizan principalmente en las Matrix Attachment Regions (MAR), del ADN de unión a la matriz nuclear. Ambos tipos de lesiones inciden negativamente en los procesos reproductivos, pero mientras las que afectan a una única cadena del ADN (SDF de SSB) repercutirán en las tasas de concepción, el tiempo para conseguir la gestación de forma natural o en el número de ciclos fallidos de FIV, las lesiones que perjudican a las dos cadenas del ADN (SDF de DSB) se han asociado al aborto de repetición, al fallo de implantación y al desarrollo lento de los embriones18,19.
En un estudio que evalúa los efectos de las roturas del ADN en la morfocinética de los embriones, se observó que la SSB enlentecía la cinética de estos en la fase de pronúcleos, aunque luego se restauraba en las siguientes etapas. Por el contrario, las DSB producían un retraso en todas las etapas del desarrollo, principalmente en la extrusión del segundo corpúsculo polar y el estadio de mórula, momento en el que se activa el genoma embrionario. Estas alteraciones en la doble cadena tenían una correlación negativa con la implantación18.
La causa más importante de la SDF de cadena simple son las especies reactivas del oxígeno (ROS)20–22. De acuerdo con Agarwal et al.23 más de 80% de los hombres infértiles presentan niveles patológicos de ROS en el semen. Generalmente, estos son debidos a un incremento en su producción y no a una disminución en la capacidad antioxidante del plasma seminal24. Las ROS, además, afectan negativamente a la motilidad al causar alteraciones en la membrana espermática, el axonema y las mitocondrias del espermatozoide13,25. La SDF de doble cadena endógena puede tener su origen en la falta de reparación del ADN durante la formación del crossover en la meiosis, o durante la espermiogénesis cuando las histonas son sustituidas por protaminas19. Mientras que el daño del ADN de cadena simple podría ser enmendado por el ovocito, la reparación del ADN cuando se trata de SDF de doble cadena dependerá del grado de SDF y de la calidad genética y citoplasmática del ovocito.
Técnicas de diagnóstico de fragmentación del ADNExisten diferentes técnicas para medir los niveles de SDF espermático, siendo los más utilizados, el Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA), el Sperm Chromatin Dispersion (SCD), el Single-Cell Gel Electrophoresis (Comet) y el Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling (TUNEL). Los dos primeros miden el daño potencial y la susceptibilidad a la desnaturalización del ADN y, por tanto, hacen una medición indirecta de la SDF del espermatozoide, mientras que los dos últimos calculan el daño real en el ADN.
Según Esteves et al., existe una buena correlación entre los índices de SDF medidos por TUNEL, SCSA, SCD y Comet alcalino8. A este respecto, Ribas et al., corroboran en un artículo de revisión esa correlación para la detección del SSB, pero apuntan a que esa correlación no se observa cuando el objetivo es medir el grado de SDF de cadena doble, y afirman que el Comet neutro sería la única técnica capaz de detectar las DSB en las regiones MAR19.
Impacto de la fragmentación del ADN espermático y el uso de los microfluidos en los resultados de fecundación in vitroLa SDF se ha asociado a bajas tasas de fecundación en FIV, desarrollo embrionario subóptimo, aborto e incluso enfermedad en la infancia26. El nivel de SDF considerado patológico varía según los estudios. Unas publicaciones consideran anómalo un grado de SDF superior a 1527,28 o a 30%29–31, mientras que otras sitúan este en 60%32,33.
A pesar de la falta de consenso sobre el valor de corte de SDF que permita discriminar entre muestras patológicas y normales y buen o mal pronóstico reproductivo, en los laboratorios de FIV de todo el mundo se están utilizando los dispositivos basados en la tecnología de microfluidos para seleccionar espermatozoides libres de SDF de doble cadena. Estos dispositivos han sido diseñados simulando el tracto genital femenino, donde de forma natural se seleccionan los espermatozoides con mayor capacidad para alcanzar el óvulo. El sistema de microfluidos más empleado actualmente es el ZyMōt®ICSI (antes Fertile® chip) (KOEK Biotechnology, Bioengineering and Medical Services Industry & Trade Ltd. Co., Balçova/Izmir, Turquía), y consiste en cámaras conectadas por microcanales. La muestra de semen sin procesar es depositada en una de las cámaras (la de origen) y los espermatozoides con mejor morfología y movilidad son recuperados en una de salida. El diseño del dispositivo evita que aquellos que son anormales o tienen una movilidad alterada lleguen a la cámara de salida, donde serán recogidos los espermas que van a ser usados en la microinyección.
Estudios que validan los microfluidos como técnica para disminuir la fragmentación del ADN espermático de la muestraNumerosos estudios han demostrado la superioridad de este tipo de dispositivos en comparación con los métodos convencionales de selección espermática para disminuir el porcentaje de espermatozoides con SDF de la muestra34.
Quinn et al. comparan los niveles de SDF obtenidos utilizando gradientes de densidad o el chip Fertile® para preparar las muestras de 70 pacientes infértiles. Los grados de SDF en las muestras procesadas con Fertile® fue de 0%, mientras que, en las preparadas con gradientes de densidad, el valor medio de SDF fue de 6%. El método para medir la SDF del ADN fue el SCD35.
Parrella et al., en un estudio realizado en un grupo reducido de parejas sometidas a inyección espermática intracitoplasmática (ICSI) (n = 23), encuentran que la utilización del ZyMōt®ICSI disminuye el grado de SDF de la muestra (1,8 ± 1) contrastado con los gradientes de densidad (12,5 ± 5) de forma significativa (p < 0,001), y en comparación con los niveles medidos en el eyaculado (20,7 ± 10; p < 0,0001). Los autores asocian el uso de los microfluidos a la mejora en los resultados clínicos obtenidos en esos ciclos, aunque no alcanzaron la significancia estadística36.
Lara et al. comparan en un estudio retrospectivo los resultados obtenidos en 28 parejas infértiles que realizaron dos ciclos de FIV. En el primero, que resultó fallido, se utilizaron técnicas convencionales de selección espermática mientras que, en el segundo, tras constatar niveles de SDF de doble cadena superiores a 60%, emplearon el dispositivo Zymot®ICSI. El método llevado a cabo para medir el grado de SDF de doble cadena fue el Comet neutro. No se obtuvieron contrastes en las tasas de fecundación obtenidas en ambos ciclos de FIV, pero sí hubo diferencias significativas en la de embarazo bioquímico y clínico, así como en la de recién nacido vivo32. A la vista de estos resultados, podría decirse que, en pacientes con elevados niveles de SDF de doble cadena de ADN, el uso del dispositivo Zymot®ICSI podría mejorar los hallazgos clínicos.
Pujol et al.33 validan la utilización del dispositivo Zymot®ICSI antes de introducirlo en la práctica clínica, empleando la muestra de nueve individuos con índices de DSB superiores a 60%. La técnica usada para detectar la DSB fue el Comet neutro. En todos los casos, la reducción media en porcentaje de la fragmentación de doble cadena fue de 64,78% con respecto al valor medido en el eyaculado sin tratar. En este mismo estudio, los autores presentan los resultados obtenidos en 163 ciclos consecutivos de FIV/ICSI en los que los pacientes mostraban niveles superiores a 60% de DSB, y en los que se usó el dispositivo Zymot®ICSI. En todos los casos, se trataba de primeros intentos de FIV, la edad media de las usuarias fue de 37,6 años y se utilizaron ovocitos propios. La tasa de nacido vivo acumulada fue de 41,98% y la de aborto de 14,43%. Según los autores, y con base en la literatura, los elevados niveles de DSB detectados en los sujetos incluidos en el estudio, se asocian a bajas tasas de implantación18 y abortos recurrentes37, y concluyen que los buenos resultados clínicos que se tuvieron en el grupo estudiado podrían atribuirse a la disminución del porcentaje de espermatozoides con DSB y al uso del dispositivo Zymot®ICSI.
Marinaro et al., en una revisión muy reciente y exhaustiva sobre el impacto de la SDF en los tratamientos de fertilidad, concluyen que los microfluidos disminuyen la SDF de una forma significativa pero que la heterogeneidad de los estudios publicados hasta el momento y la omisión de aspectos de gran impacto en los resultados clínicos analizados, como la edad de la mujer, no permiten concluir que los microfluidos mejoren los hallazgos clínicos38.
Estudios sobre el impacto de la fragmentación del ADN espermático en los resultados de fecundación in vitroKhalafalla et al.29 presentan los hallazgos obtenidos en 392 ciclos de FIV/ICSI en los que se cuantificó el grado de SDF mediante SDF (Halosperm G2 Kit, HALOTECH DNA, S.L., Madrid, España). Estos fueron analizados en función del grado de SDF (< 20, 20-30 y > 30%) y el pronóstico reproductivo de la mujer: (< 35 y ≥ 7,1 pmol/L, bueno) y (> 35 y ≤ 7,1 pmol/L, malo). Los autores analizan los resultados clínicos de acuerdo con el grado de SDF y no encuentran diferencias reveladoras en las tasas de fecundación, embarazo clínico, nacido vivo y tasa de aborto. Al revisar los hallazgos, considerando el grado de SDF y el pronóstico reproductivo de la mujer, los autores observan tasas de embarazo y nacido vivo superiores y estadísticamente significativas, cuando el nivel de SDF es superior a 30%, en el subgrupo de pacientes de buen pronóstico en comparación con aquel en el que este es malo. Los autores atribuyen los resultados obtenidos en este grupo a la capacidad que tiene el ovocito joven de reparar la SDF durante la embriogénesis.
Hervas et al.28 analizan en un estudio multicéntrico retrospectivo los hallazgos de FIV en 1.339 parejas (2.759 ciclos) con diferentes grados de SDF. La técnica empleada para medir la SDF fue el TUNEL y se realizó en los tres meses previos al tratamiento de FIV/ICSI. Los resultados se evaluaron teniendo en cuenta el índice de SDF (≤ 15 o > 15%). Las indicaciones para cuantificar la SDF fueron una baja movilidad espermática, infertilidad de larga duración de causa desconocida, fallo de implantación y abortos previos. Los autores no encontraron diferencias en ninguno de los indicadores revisados: tasa de nacido vivo acumulada o desarrollo embrionario en los días tres o cinco, y concluyen que no hay relación entre el grado de SDF y los resultados clínicos en pacientes que utilizan ovocitos propios. Apuntan también que no hay un valor de corte claro que permita discriminar entre varón fértil o infértil o éxito o fracaso de las TRA, pero que el grado de SDF podría ayudar a interpretar el fallo de FIV cuando la muestra de semen es normal.
Otro trabajo multicéntrico retrospectivo llevado a cabo por el mismo grupo27, en el que se incluyeron 1.903 ciclos con ovocitos procedentes de donación y muestra seminal en fresco con SDF cuantificada con anterioridad al día del ICSI mediante TUNEL (SDF bajo < 15% y SDF alto > 15%), tampoco mostró diferencias significativas en los resultados obtenidos en cuanto a calidad embrionaria, tasa de implantación y acumuladas de nacido vivo.
Yildiz et al.39, en un estudio prospectivo randomizado en el que incluyeron 428 pacientes con indicación de esterilidad de origen desconocido y fallo recurrente de FIV, comparan los resultados obtenidos con la utilización del Fertile Chip® (116 casos) o gradientes de densidad (312) para preparar la muestra de semen. Los pacientes fueron divididos en función del número de intentos de FIV (primer ciclo o uno o más ciclos previos fallidos). En el grupo de aquellos que se sometían a su primer periodo de FIV, no hubo diferencias significativas en las tasas de fecundación y embarazo comparando Fertile Chip® y gradientes de densidad. En contraposición, en el grupo de usuarios con uno o más ciclos de FIV fallidos, el uso del Fertile Chip® mejoró la tasa de fecundación de forma significativa, aunque no se apreciaron diferencias relevantes en la de gestación. Los autores concluyen que, en los pacientes con intentos de FIV fallidos, estaría indicada la realización de una prueba de SDF antes de iniciar un nuevo tratamiento y que el uso generalizado de los microfluidos en las primeras veces de FIV no está justificado.
En 2020 Ozcan et al.40 llevaron a cabo una investigación en la que comparaban los resultados obtenidos empleando microfluidos o gradientes de densidad en 180 parejas en las que el varón había sido diagnosticado de oligoastenoteratozoospermia, las mujeres presentaban marcadores de reserva ovárica dentro de la normalidad y tenían entre 20-40 años, así como ausencia de patología uterina. Al comparar los hallazgos clínicos no se encontraron diferencias estadísticamente significativas ni en la tasa de embarazo, ni en la de embarazo evolutivo, ni en la de fecundación, aunque fue superior en las pacientes que habían utilizado los microfluidos. Otros estudios, sobre factor masculino y el uso de esta tecnología demuestran, por el contrario, que los resultados clínicos (tasas de embarazo, de embarazo acumulada y de nacido vivo) mejoran con el uso de los microfluidos41,42.
Kocur et al.30, en un trabajo muy reciente, analizan los resultados obtenidos en 76 parejas en las que, tras realizar un total de 168 ciclos con resultados inesperadamente subóptimos (tasa de embarazo de 16,6% y de aborto de 52,3%), se indica un estudio de SDF. El método de análisis fue el TUNEL y la tasa de SDF media encontrada de 21,6%. En todos los casos se realizó un nuevo intento de FIV/ICSI con el empleo del Zymot®ICSI o la recuperación de espermatozoides mediante biopsia testicular para disminuir el grado de SDF en la muestra. En ambos casos, mejoraron significativamente las tasas de embarazo clínico y de aborto.
Edad materna y reparación del ADNEl espermatozoide está implicado en procesos clave del desarrollo del embrión preimplantatorio, como la activación de la transcripción de los ARN mensajeros (mARN) de origen materno, la compactación, la activación del genoma embrionario, los cambios metabólicos o la diferenciación celular en el blastocisto43. El daño en el ADN espermático que no sea reparado por el propio espermatozoide o por el ovocito será heredado por el embrión, lo que compromete su capacidad de desarrollo e implantación44.
Los estudios publicados hasta el momento sobre el impacto de la SDF del ADN espermático en los resultados de FIV asocian o atribuyen ese impacto a la calidad del ovocito y a su capacidad para reparar el daño en el ADN. En este sentido, los resultados obtenidos en ciclos con ovocitos propios y de donante en los que el semen presentaba niveles elevados de SDF en el ADN, son contradictorios y ponen en cuestión la relevancia clínica del daño en el ADN espermático, con independencia de la calidad del ovocito.
En cuanto a la capacidad de reparación del ADN en ovocitos, estudios recientes han confirmado que el ovocito tiene capacidad de reparación del ADN en todos los estadios del desarrollo, desde el de folículo primordial al de metafase II45. La capacidad de reparación del ADN de los zigotos y embriones tempranos dependerá del pool de mRNA y proteínas heredadas de la madre. Será a partir del estadio de cuatro a ocho células, en el se produce la activación del genoma embrionario, cuando el embrión activará los checkpoints de ciclo celular y podrá sintetizar las proteínas implicadas en la reparación del ADN.
Algunos de los mecanismos de reparación, descritos en células germinales son ya conocidos en las somáticas. Así, a lo largo del desarrollo de ovocitos y cigotos humanos, se han identificado genes y proteínas involucrados en el reparo por escisión de bases, en el de SSB y DSB, y en el dado por escisión de nucleótidos46. No obstante, se desconoce el grado y el tipo de daño que el ovocito es capaz de enmendar y cuáles son los mecanismos exactos para ello. La importancia de los dispositivos de restauración del ADN en el desarrollo de los embriones ha sido demostrada en estudios con modelos animales en los que se ha evidenciado que la disminución de la actividad de genes implicados en estos conducía a una menor tasa de desarrollo a blastocisto y a una calidad del blastocisto deficiente47. A medida que los ovocitos envejecen, la eficiencia de reparación del ADN se reduce debido a que los niveles de expresión de genes clave en la restauración del ADN, como BRCA1, MRE11 o RAD51 son menores48. Esto da como resultado un mayor número de defectos en el ADN, como SSB o anomalías cromosómicas que podrían explicar los malos resultados reproductivos en pacientes de mayor edad o con ovocitos de mala calidad. Por otro lado, aunque los mecanismos de arreglo del ADN funcionen correctamente en el ovocito, estos no son ilimitados. Si los niveles de ADN irreparado exceden un determinado umbral, el desarrollo embrionario y la capacidad de implantación del embrión se verán afectados44.
ConclusionesDebido a la heterogeneidad encontrada en los estudios publicados en cuanto a metodología y resultados obtenidos, es difícil establecer una relación clara entre la SDF y los hallazgos clínicos de FIV. Por otra parte, no se han encontrado los valores estandarizados de normalidad para las diferentes pruebas de cuantificación de la SDF, que permitirían diferenciar entre muestras fértiles o infértiles o discriminar entre buen o mal pronóstico reproductivo. Se desconoce igualmente cuál es la prevalencia de la SDF elevada en condiciones clínicas determinadas como el aborto de repetición o el fallo de implantación recurrente. Por último, no se sabe cuáles son los mecanismos precisos de reparación del ADN y el tipo y complejidad del daño de origen espermático que el ovocito de buena calidad es capaz de reparar, aspecto fundamental a la hora de interpretar los resultados de FIV en función del grado de SDF.
Aunque son necesarios nuevos estudios que den respuesta a esos y otros aspectos básicos sobre la SDF, de la revisión bibliográfica realizada para este artículo se podría extraer, en primer lugar, la idea de que, en determinados casos, como en los fallos repetidos de FIV con muestra de semen normal, la realización de una prueba de fragmentación del ADN podría ayudar a interpretar el fracaso de la FIV. Niveles elevados de SDF en esas situaciones podrían enmascarar un factor masculino oculto. En segundo lugar, que la tecnología de microfluidos es una técnica válida de selección de espermatozoides libres de fragmentación de doble cadena de ADN, que en determinados casos podría contribuir a la mejora de los resultados.
FinanciaciónEste trabajo no ha recibido ningún tipo de financiación.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
