El aneurisma de aorta torácica ascendente (AATA) es una dilatación progresiva de la aorta que puede complicarse con su disección causando la muerte del 80-90% de los pacientes. Cuando se asocia con el envejecimiento y la aterosclerosis su pronóstico es peor, siendo la cirugía reconstructiva la única terapia disponible. Nuestro objetivo es caracterizar el perfil de genes expresados diferencialmente (GED) implicados en el estrés del retículo endoplasmático (RE) y la disfunción mitocondrial en pacientes con AATA degenerativo.
MétodosMediante secuenciación de ARN utilizando ARN extraído de AATA de pacientes degenerativos (n=13) y donantes multiorgánicos sanos (n=6) identificamos GED relacionados con el estrés del RE y la disfunción mitocondrial con el paquete DESeq2. El análisis de vías enriquecidas (Reactome) y de interacción de proteínas se realizó con el paquete clusterProfiles y se analizó con la base de datos String y el software Cytoscape.
ResultadosLa histología reveló una desorganización completa de la matriz extracelular y pérdida celular en la pared aórtica de los pacientes donde detectamos una regulación positiva de 15 GED y negativa de 13 GED relacionados con el estrés del RE (ATF4, EIF2AK3, HSPA5, ERN1, SEL1L), la disfunción mitocondrial (DNML1, IMMT, MT-CO3, MT-CYB, MT ND2, TIMM17B, MT-ERF1, TOMM5) y la remodelación de la matriz extracelular. Los resultados del análisis del término GO y de las vías enriquecidas confirmaron la relación de estos GED con enfermedades de la aorta.
ConclusionesNuestros datos demuestran que las proteínas relacionadas con la disfunción mitocondrial y el estrés del RE podrían postularse como dianas terapéuticas para tratar el AATA.
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Ascending Thoracic Aortic Aneurysm (ATAA) is a progressive dilation of the aorta that can be complicated by its dissection leading to death in 80-90% of the patients. When associated with aging and atherosclerosis, the outcome is worse and reconstructive surgery is the only effective therapy. Our objective was to characterize differential expressed genes (DEG) involved in endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria dysfunction in patients with degenerative ATAA.
MethodsA transcriptomic analysis was performed by RNA sequencing using RNA isolated from ATAA of patients classified as degenerative (n=13) and multi-organ healthy donors (n=6). DEGs related to ER stress and mitochondrial dysfunction were identified with the DESeq2 package. Enriched pathway (Reactome) and protein interaction (PPI) analysis was performed with the clusterProfiles package. PPI of the selected DEGs was analyzed based on the string database and visualized by Cytoscape software.
ResultsHistology revealed a complete disorganization of the extracellular matrix (ECM) and cell loss in the aortic wall of ATAA patients where the upregulation of 15 DEGs and the downregulation of 13 DEGs that encode proteins related to ER stress (ATF4, EIF2AK3, HSPA5, ERN1, SEL1L), mitochondrial dysfunction (DNML1, IMMT, MT-CO3, MT-CYB, MT ND2, TIMM17B, MT-ERF1, TOMM5) and ECM was detected. The results of GO term and enriched pathway analysis indicated that these DEGs are mainly enriched in pathways related to aortic diseases.
ConclusionsOur data show that proteins related to mitochondrial dysfunction and ER stress might be therapeutic targets for the treatment of ATAA.
El aneurisma aórtico es una dilatación localizada y permanente de la aorta que puede afectar tanto a la aorta torácica (AAT) como a la región abdominal (AAA)1. A medida que la enfermedad progresa, la pared aórtica se debilita y dilata de forma gradual, un proceso que finalmente puede desembocar en una rotura aórtica, la complicación más grave de la enfermedad, que está relacionada con una mortalidad del 50-80%2. En efecto, el aneurisma aórtico es la decimoquinta causa de muerte en personas mayores de 55 años y la decimonovena causa de muerte en general2. Los aneurismas de la aorta torácica ascendente (AATA) o descendente y los AAA son entidades patológicas distintas, con factores de riesgo que difieren entre sí3,4.
Ciñéndonos específicamente a los AAT, estos pueden crecer asintomáticamente hasta romperse, con una mortalidad superior al 90%. La verdadera incidencia y prevalencia de esta afección es incierta y los datos epidemiológicos son escasos y dispersos5–7. No obstante, se estima que el AAT tiene una incidencia de 5,3 por 100.000 personas/año y una prevalencia del 0,16%5,6. La incidencia de AAT es similar entre hombres y mujeres, pero se diagnostica una década antes en los hombres (a los 60 años en hombres frente a los 70 en mujeres). Según su localización, los AAT se clasifican en aneurismas de la raíz aórtica o AATA, que son los más frecuentes (≈60%), seguidos de los aneurismas de la aorta descendente (≈35%) y del arco aórtico (<10%)3,4.
El AATA afecta al 1% de la población general y en estos pacientes la aorta incrementa su diámetro un promedio de 0,14cm por año5,6. Se trata de una afección silente y potencialmente mortal debido a la disección de la pared aórtica8–10. Alrededor del 22% de los pacientes con síndrome aórtico agudo mueren en casa, antes de recibir atención médica, mientras que la mortalidad hospitalaria llega al 34%5,7. Hasta la fecha el tratamiento quirúrgico es la única estrategia terapéutica capaz de limitar la incidencia de disección aórtica, por lo que precisamos urgentemente de una terapia farmacológica efectiva que reduzca la progresión y el riesgo de rotura del aneurisma. Este aspecto se ha visto dificultado por el desconocimiento acerca de la asociación entre las propiedades biomecánicas locales y los cambios tisulares, celulares y moleculares que intervienen en la patogénesis de la AATA11.
Se ha demostrado que el AATA, a diferencia del AAT descendente, se desencadena mayoritariamente por causas genéticas6,12. La aterosclerosis no se considera una de las principales causas del AATA, ya que los pacientes con disección de la aorta ascendente normalmente no presentan signos de aterosclerosis o calcificación y la enfermedad no está asociada con factores de riesgo aterosclerótico13–16. Sin embargo, existe un grupo de pacientes con AATA asociado con aterosclerosis y envejecimiento, clasificados como sujetos con aortopatía degenerativa aterosclerótica en los que no se han encontrado causas genéticas. La esperanza de vida de los pacientes con AAT se puede mejorar si la enfermedad se diagnostica a tiempo, se interviene quirúrgicamente y se realiza un control adecuado de la presión arterial9,10,17. La identificación de los mecanismos subyacentes al AATA puede contribuir a mejorar tanto la comprensión de esta enfermedad como la estratificación de los pacientes atendiendo al riesgo de rotura del AATA, y permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas para contrarrestar el remodelado mecanosensible de la matriz.
Recientemente, en estudios realizados por nuestro grupo y por otros autores, se ha demostrado la implicación del estrés del retículo endoplasmático (RE) y de la disfunción mitocondrial tanto en la fisiopatología del AAA en humanos como en la formación de aneurismas en pacientes con síndrome de Marfan18–22. De hecho, existe una estrecha interrelación entre el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO), estas últimas con un papel fundamental en enfermedades cardiovasculares23–25.
El mal funcionamiento del RE puede verse empeorado por la disfunción mitocondrial, que provoca cambios en el comportamiento celular causando agotamiento energético y, finalmente, muerte celular, lo que eventualmente contribuye al desarrollo de la enfermedad aneurismática26–29. Sin embargo, se desconoce si estos procesos desempeñan un papel relevante en el AATA. Este estudio tiene como objetivo caracterizar la contribución del estrés de RE y la disfunción mitocondrial a la formación de AATA en pacientes de edad avanzada con aortopatía aterosclerótica, con el objetivo último de identificar nuevas dianas terapéuticas que mejoren el manejo de estos pacientes. Para ello, hemos realizado un análisis transcriptómico que nos ha permitido identificar genes asociados al estrés del RE y a la disfunción mitocondrial, potencialmente implicados en la enfermedad, y ha caracterizado su relación funcional con proteínas que participan en el remodelado de la matriz extracelular (MEC) y en la producción de especies reactivas de oxígeno.
MetodologíaMuestras de pacientesLa población de estudio está compuesta por 19 sujetos, entre los que se incluyen pacientes con AATA y donantes multiorgánicos. Las muestras se obtuvieron durante la cirugía de raíz aórtica electiva o de urgencia a causa de la disección del AATA. Los datos clínicos de los pacientes incluidos en el estudio se recogieron respetando su anonimato. La Unidad Funcional de Patología de la Aorta del Servicio de Cardiología del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (HSCSP, Barcelona), proporcionó las muestras de aneurisma ascendente aórtico humano procedentes de pacientes con aterosclerosis aórtica (58-83 años) sometidos a cirugía correctiva de aneurisma de la aorta ascendente. Las características de los pacientes se muestran en la tabla 1.
Datos de los pacientes incluidos en el análisis de secuenciación de ARN
| Variable | Total (n=19) | Controles (n=6) | AATA(n=13) | Valor p |
|---|---|---|---|---|
| Sexo, n (%) | 1,000 | |||
| Hombre | 13 (68,4%) | 4 (66,7%) | 9 (69,2%) | |
| Mujer | 6 (31,6%) | 2 (33,3%) | 4 (30,8%) | |
| Edad, media (ES) | 61,9 (2,82) | 54,6 (1,73) | 65,8 (3,85) | 0,032 |
| Fumador/a, n (%) | 1,000 | |||
| Sí | 9 (47,4%) | 3 (50,0%) | 6 (46,2%) | |
| Hipertensión, n (%) | 0,386 | |||
| No | 5 (26,3%) | 3 (50,0%) | 2 (15,4%) | |
| Sí, controlada | 7 (36,8%) | 2 (33,3%) | 5 (38,5%) | |
| Sí, no controlada | 7 (36,8%) | 1 (16,7%) | 6 (46,2%) | |
| Diabetes mellitus tipo 2, n (%) | 1,000 | |||
| No | 18 (94,7%) | 6 (100%) | 12 (92,3%) | |
| Sí, no-controlada | 1 (5%) | - | 1 (7,7%) | |
| Dislipidemia, n (%) | 0,288 | |||
| No | 13 (68,4%) | 4 (66,7%) | 9 (69,2%) | |
| Sí, controlada | 3 (15,8%) | - | 3 (23,1%) | |
| Sí, no controlada | 3 (15%) | 2 (33,3%) | 1 (7,7%) | |
| Fármacos, n (%) | ||||
| Estatinas | 2 (10,5%) | - | 2 (15,4%) | 1,000 |
| Antiagregantes | 3 (15,8%) | - | 3 (23,1%) | <0,001 |
| Anticoagulantes | 1 (5,3%) | - | 1 (7,7%) | <0,001 |
| Miocardiopatías, n (%) | 0,101 | |||
| No | 9 (47,4%) | 1 (16,7%) | 8 (61,5%) | |
| Dilatada | 5 (26,3%) | 3 (50,0%) | 2 (15,4%) | |
| Hipertrófica | 3 (15,8%) | 2 (33,3%) | 1 (7,7%) | |
| Valvular | 2 (10,5%) | - | 2 (15,4%) | |
| Diámetro raíz aórtica (mm), media (ES) | - | - | 40,4 (1,30) | - |
| Diámetro aorta ascendente (mm), media (ES) | - | - | 52,7 (2,70) | - |
| Diámetro unión sinotubular (mm), media (ES) | - | - | 41,0 (1,66) | - |
Las variables categóricas se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Las variables continuas se compararon mediante el la prueba «t» de Student.
AATA: aneurisma de aorta torácica ascendente; ES: error estándar.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica del HSCSP, Barcelona (ref. IIBSP-MAR-2019-08), y todas las muestras recogidas forman parte de la colección C.0005273, registrada en el Instituto de Salud Carlos III.
Las aortas ascendentes procedentes de los donantes multiórganicos (controles sanos [CS]) no presentaban signos de aterosclerosis y/o aneurisma en la aorta y fueron proporcionadas por el Banco de Tejidos de Barcelona para su uso con fines de investigación, que fue aprobado por el Comité Ético de esta institución. Este trabajo se ha llevado a cabo siguiendo la Declaración de Helsinki. La participación de los pacientes y la recogida de muestras de sujetos tomados como control se realizó con el consentimiento informado de los pacientes o de sus representantes legales. Se recogieron muestras de tejido y se almacenaron a –80°C para los estudios posteriores. Parte de los tejidos se fijaron inmediatamente en paraformaldehído, se mantuvieron a temperatura ambiente durante 48horas y se incluyeron en parafina para la caracterización histológica de las muestras.
Aislamiento de ARN a partir de tejido humano, control de calidad, construcción de bibliotecas y secuenciaciónPara identificar los genes expresados diferencialmente entre la aorta de controles sanos y pacientes con AATA se realizó un análisis del genoma completo mediante secuenciación de ARN (Novogene). El ARN total se extrajo de 25 muestras de tejido de la aorta ascendente que son representativas de la condición patológica (AATA, n=18) y de los donantes multiorgánicos tomados como controles sanos (CS, n=7) utilizando el mini kit RNeasy Fibrous (Qiagen, Venlo, Países Bajos), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se determinó y cuantificó mediante un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y su integridad y calidad se evaluaron en un bioanalizador Agilent 2100 (Aligent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Para la secuenciación del ARN, aquellas muestras que no alcanzaron los valores de integridad del ARN requeridos se excluyeron del ensayo, en el que finalmente se incluyeron 13 AATA y 6 CS. Se utilizó ARN total como material de partida para sintetizar bibliotecas de ADN complementario (ADNc) utilizando el kit Illumina Stranded mRNA Prep basado en el método de selección de poli-A, siguiendo el protocolo del fabricante (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). Brevemente, el ARN mensajero se purificó a partir del ARN total utilizando perlas magnéticas unidas a oligo poli-T. Después de la fragmentación se sintetizó el ADNc de la primera cadena utilizando cebadores hexámeros aleatorios, seguido de la síntesis de ADNc de la segunda cadena utilizando dUTP para la biblioteca direccional o dTTP para la biblioteca no direccional. Finalmente se secuenciaron simultáneamente en el sistema de secuenciación Illumina NextSeq 500 con el kit de reactivos de alto rendimiento NextSeq 500/550 v2.5 de 150 ciclos (extremo emparejado de 2x74 pb) de Illumina.
Los archivos de secuencia emparejados en formato FASTQ se analizaron en la plataforma BaseSpace Sequence Hub con Dragen RNA Pipeline v3.7.5 (Illumina). El genoma de referencia utilizado fue UCSC hg19. El archivo de datos original de plataformas de secuenciación de alto rendimiento (Illumina) se transformó en lecturas secuenciadas mediante el reconocimiento de base CASAVA (Base Calling). Los datos sin procesar se almacenaron en archivos de formato FASTQ(fq), que contienen secuencias de lecturas y la calidad de base correspondiente.
Para normalizar las lecturas del RNA-seq y obtener los fragmentos por kilobase de transcritos por millón de fragmentos mapeados (FPKM) se utilizaron los paquetes «limma», «DEseq2» y «conuntToFPKM» del programa estadístico R versión 4.4.0 (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Disponible en: http://www.r-project.org/).
Análisis de la expresión génicaCon los datos del análisis transcriptómico, y a partir de los FPKM calculados en cada muestra y comparando entre los grupos de estudio AATA y CS, se cuantificó la expresión génica de los genes relacionados con el remodelado de la MEC que codifican para las metaloproteinasas MMP1, MMP2 y MMP9; para la elastina (ELN), fibrilina 1 (FBN1) y fibulina 5 (FBLN5) y para los colágenos COL1A1, COL3A1, COL5A1, COL7A1, COL24A1 y COL26A1. Se cuantificó la expresión de los genes relacionados con el estrés del retículo endoplasmático: activating transcription factor-4 (ATF) que codifica para el factor de activación de la transcripción 4, EIF2AK3, que codifica para la quinasa del retículo endoplasmático similar a la proteína quinasa R (PERK); HSPA5, que codifica la chaperona molecular GRP78/BIP; ERN1, que codifica la enzima 1 α que requiere inositol (inositol requiring enzyme 1 [IRE-1]); SEL1L que codifica la proteína homóloga 1 de la proteína sel-1 y con el estrés oxidativo: NOX2 y NOX4. Finalmente, se cuantificó la expresión de los genes implicados en la disfunción mitocondrial: DNML1 que codifica la proteína similar a la dinamina-1 (dynamin related protein 1 [DRP1]); IMMT, que codifica la proteína mitofilina; MFF que codifica el factor de fisión mitocondrial; MT-CO3, que codifica la subunidad 3 de la citocromo C oxidasa; MT-CYB, que codifica el citocromo B; MT ND2 que codifica la subunidad 2 de la enzima NADH deshidrogenasa; TIMM17B, que codifica la translocasa 17B de la membrana interna mitocondrial; MT-ERF1, que codifica el factor 1 de la terminación de la transcripción mitocondrial y TOMM5, que codifica la translocasa de la membrana externa mitocondrial 5.
Análisis de interacción proteína-proteínaEl análisis de la interacción proteína-proteína (IPP) de genes relacionados con los procesos de remodelado de la MEC, estrés del retículo endoplasmático, estrés oxidativo y disfunción mitocondrial se realizó utilizando la base de datos String, estableciéndose como puntuación mínima de interacción>0,4, considerándose estadísticamente significativos con un valor de p<0,05 y un valor de False Discovery Rate (FDR) del 5%; los resultados se visualizaron en el software Cytoscape (v3.7.2).
Análisis de enriquecimiento Over Representing Analysis en Disease Gene Network y Online Mendelian Inheritance in ManLos genes relacionados con los procesos de remodelado de la MEC, estrés del retículo endoplasmático, estrés oxidativo y disfunción mitocondrial con expresión genética diferencial fueron anotados para el análisis de enriquecimiento Over Representing Analysis (ORA) con el paquete «clusterProfiler» del programa estadístico R y el WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit (WebGestalt) con las categorías de enriquecimiento de las bases de datos Disease Gene Network (DisGeNET) y Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) por el método Benjamini & Hochberg y con un valor de FDR<0,05.
Análisis histológicoLas muestras de tejido se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. La caracterización histológica de las muestras de aorta humana se llevó a cabo mediante tinciones con tricrómico de Mason y rojo sirio, mientras que la integridad de las fibras elásticas se evaluó mediante tinción con orceína utilizando un kit comercial (Casa Álvarez, Madrid, España), tal y como se describió previamente30,31. Para ello, las secciones se desparafinaron en xilol, se rehidrataron mediante una batería de alcoholes de gradación descendente y se sumergieron en agua destilada durante 5minutos. Después de los distintos procedimientos de tinción, las muestras se deshidrataron lavándolas en alcohol de 100° (3×2min), seguido de 2 lavados en xilol de 3min. Finalmente, los portaobjetos se montaron con medio de montaje DPX (Casa Álvarez, España). Las muestras se escanearon con un escáner Pannoramic Midi I Automatic brightfield scan (3DHISTECH) para su visualización y captación de imágenes representativas con el software CaseViewer 2.3.
Análisis estadísticoEl análisis estadístico se realizó utilizando el software R, versión 4.3.3 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria. Disponible en: http://www.r-project.org/) y el software GraphPad Prism versión 9.2.20 (La Jolla, CA, EE.UU.). Los valores de p≤0,05 se consideraron significativos mediante el test estadístico bilateral. Además, se comprobó la distribución normal de las variables continuas mediante el test de Shapiro-Wilk.
Las características demográficas y clínicas de los participantes se expresaron como media±SEM si eran variables continuas. Las variables categóricas se presentaron como frecuencia y se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Los resultados de la expresión génica se expresan como mediana y rango intercuartílico y las diferencias entre grupos (pacientes con AATA versus CS) se evaluaron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney. El número (n) de muestras se indica en las leyendas de las figuras.
ResultadosLa media de edad de los pacientes con AATA fue de 66 años, 10 años mayor que la de los sujetos controles. La mayoría padecía hipertensión (84,56%), pero no dislipidemia (30,7%) y solo un 38,5% recibía tratamiento antihipertensivo. Alrededor del 50% de los pacientes involucrados en el estudio estaba siendo tratado con fármacos hipocolesterolemiantes como estatinas, antiagregantes y anticoagulantes y eran fumadores (tabla 1). La aorta ascendente se consideró dilatada si el diámetro era de 45mm o más, que es el límite actual para la recomendación de cirugía aórtica.
Histopatología de la pared vascular de pacientes con aneurisma de aorta torácica ascendenteLa morfología de la pared del vaso se estudió mediante las tinciones con tricrómico de Mason, orceína y rojo sirio. La pared aórtica se analizó histológicamente de forma estandarizada utilizando el sistema de clasificación descrito en el documento de consenso aórtico sobre enfermedad quirúrgica de la aorta32–34.
La degeneración de la capa media (DM) fue la característica histopatológica más común encontrada en el AATA causada por la descomposición del tejido de la pared aórtica y/o fragmentación de las fibras elásticas (fig. 1). Así, en cortes de muestras de los aneurismas identificamos la pérdida de núcleos de células musculares lisas (PNCML), colapso laminar medial (CLM), fibrosis medial (FM) y acumulación de matriz extracelular mucoide (MEXM) mediante la tinción con tricrómico de Mason (figs. 1A-D). La MEXM se puede dividir a su vez en 2 tipos: intralaminar (MEXM-I) y translamelar (MEXM-T). En la MEXM-I el aumento de la MEXM no altera la disposición de las unidades laminares, a diferencia de MEXM-T33. En las figuras 1C y D se evidenció la acumulación de MEXM-T grave y en la pared del AATA de algunos pacientes se observó colapso laminar medial (indicado con flechas). A su vez, tanto la tinción con tricrómico de Mason como con rojo sirio mostraron un aumento del colágeno intralaminar, que se observa como una expansión dentro del espacio intralamelar (figs. 1C y D, indicado con flechas) causante de alteraciones cicatriciales en la disposición de las unidades laminares y un aumento del colágeno translamelar (figs. 1G y H, indicado con flechas). Este colágeno está desorganizado y desestructurado en lugar de formar haces de fibras onduladas, en comparación con la pared de las aortas sanas de donantes, donde la deposición de colágeno es más baja y exhibe una distribución normal (figs. 1E-F). La tinción con orceína reveló fragmentación de fibras elásticas y/o pérdida (FFEP), adelgazamiento de fibras elásticas (AFE) y desorganización de fibras elásticas (DFE) en la pared aneurismática de los pacientes pero no en la pared de la aorta de donantes sanos (figs. 1I, 1J, 1K, 1L).
Secciones histológicas transversales de la pared de la aorta ascendente procedentes de sujetos controles y de la pared de aortas ascendentes dilatadas de pacientes con AATA.
A-D. Se muestran capturas de áreas representativas de secciones teñidas con tricrómico de Masson donde las células del músculo liso y la fibrina se observan en rojo, mientras el colágeno se tiñe de azul. Las áreas con pérdida de núcleos de células del músculo liso se indican con flechas rojas. En B y D se observa que la capa íntima es significativamente más gruesa en la pared de la aorta ascendente de sujetos controles. E-H. Se muestran capturas de áreas representativas de secciones teñidas con rojo sirio en las que se observa el aumento en el depósito de colágeno en la capa media y adventicia de las aortas de los pacientes. I-L. Secciones teñidas con orceína. Se destaca la fragmentación observada en pacientes con AATA (flechas rojas). M-T. Capturas representativas de la inmunohistoquímica frente al marcador CD3 de linfocitos T (M-P) y al marcador CD68 de macrófagos (Q-T). Las áreas donde se encuentran células positivas al marcaje se indican con puntas de flecha.
AATA, n=6; y controles sanos, n=4. Barra: 500 micras (A, E, I, C, G, K); 200 micras (B, F, J, D, H, L, M, O, Q, S); y 100 micras (N, P, R, T).
Finalmente, evaluamos el contenido de células inmunes infiltradas en el AATA de pacientes y en la pared aórtica de los controles. La mayoría de las células inmunes presentes en la pared del aneurisma se identificaron como células T (CD3) y macrófagos (CD68), como se muestra en las figuras 1M-T.
Patrón de expresión de genes implicados en el estrés del retículo endoplasmático, en la disfunción mitocondrial y en el remodelado de la matriz extracelularA partir del análisis transcriptómico se analizó la expresión de genes normalizada por fragmentos por kilobase de transcritos por millón de fragmentos mapeados (FPKM), de genes implicados en el estrés del RE, la disfunción mitocondrial y la mitofagia, y en la síntesis, mantenimiento y destrucción de la MEC.
Así, de entre los genes expresados diferencialmente implicados en el remodelado de la MEC se encontraron aumentados significativamente las MMPs 1, 2 y 9; COL1A1, COL3A1, COL5A1, COL24A1 y COL26A1, que codifican para la cadena alfa de distintos tipos de colágenos y la FBN1, proteína estructural esencial que actúa como soporte para la deposición de las fibras de elastina (fig. 2). En contraposición, se encontró significativamente disminuida la expresión de la ELN, la FBLN5, que promueve la interacción entre microfibrillas y fibras de elastina en la pared arterial y el COL7A1 (fig. 2).
![Expresión génica de marcadores relacionados con el proceso de remodelado de la MEX en el aneurisma de aorta torácica ascendente (ATAA) de pacientes. A-F. Expresión de los genes que codifican para diferentes metaloproteinasas y proteínas esenciales que forman y mantienen la integridad de las fibras de elastina. G-L. Expresión de genes que codifican para distintos subtipos de proteínas que forman las fibras de colágeno. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Los datos se expresan como mediana y rangos de cuartiles; se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. Valor de p<0,05 considerado estadísticamente significativo.](https://static.elsevier.es/multimedia/02149168/0000003700000004/v1_202507071457/S0214916824000895/v1_202507071457/es/main.assets/gr2.jpeg?xkr=0tLLa3+BzSihla50YtSMAoLAaNjwGim28hj4mCEaADWN8n+ULei1NJbvaFiOaPahXHPTatpxCMHK66tBkGUY2flkTpfJl9PVEDIrxm9lSMdJFx0tVCl4gTKad2Jx8aPeH0zu3UpP7mMxiUPlQoTHlKg6a//XJ3Wzf7n0AyG90F1d9DkHcgL21GqDZjjxMTJquh3wRxrbrj6GBIlubK6pSLRFz0F83hgJIkukMNlsaAcViPAXMlYbIQcNH2RkYuIfe6+zHlvJLuE6l7RRx49rU/hjjdvbRUOABcvq3Bj0sqXVnUu73sdFoegbgKCJo5fg)
Expresión génica de marcadores relacionados con el proceso de remodelado de la MEX en el aneurisma de aorta torácica ascendente (ATAA) de pacientes.
A-F. Expresión de los genes que codifican para diferentes metaloproteinasas y proteínas esenciales que forman y mantienen la integridad de las fibras de elastina. G-L. Expresión de genes que codifican para distintos subtipos de proteínas que forman las fibras de colágeno. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Los datos se expresan como mediana y rangos de cuartiles; se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. Valor de p<0,05 considerado estadísticamente significativo.
En cuanto a los genes expresados diferencialmente implicados en el estrés del retículo endoplasmático y aquellos relacionados con el complejo enzimático NADPH oxidasa, se encontraron aumentados significativamente los genes EIF2AK3, ERN1, SEL1L y CYBB (fig. 3), que codifican respectivamente para las proteínas PERK, IRE1 y SEL1L, que forman parte de la respuesta a la acumulación de proteínas mal plegadas, y para la cadena beta del citocromo B-245 (NOX2), el componente terminal de la cadena respiratoria que transfiere electrones desde el NADPH citoplasmático a través de la membrana plasmática hasta el oxígeno molecular en el exterior. Por otra parte, la expresión de los genes ATF4, HSPA5 y CYBB, que codifican para otros componentes de la respuesta a la acumulación de proteínas mal plegadas, tales como el factor de transcripción ATF4, la chaperona molecular GRP78/BIP y para la subunidad catalítica del complejo NADPH oxidasa, NOX4, se encontró significativamente disminuida, indicando una regulación diferencial de las diferentes vías implicadas en la respuesta a proteínas mal plegadas y de las distintas isoformas de la NADPH oxidasa (fig. 3). Mediante el análisis realizado por regresión lineal para determinar si la edad influía en la expresión diferencial de los genes implicados en el estrés del retículo endoplasmático y el estrés oxidativo se identificó una asociación positiva con los genes ERN1, SEL1L y NOX2 (tabla 1 del material suplementario) mientras que, según el análisis de regresión logística, solo la expresión del gen EIF2AK3 interactúa con la edad y con la presencia de AATA (tabla 2 del material suplementario).
![Expresión génica diferencial de marcadores del estrés del retículo endoplasmático (ERS) y de la subunidad catalítica del complejo NADPH oxidasa en el aneurisma de aorta torácica ascendente (ATAA) de pacientes. A-D. Los genes EIF2AK3, ERN1, SEL1L y NOX2 se encontraron significativamente aumentados en el grupo de pacientes, mientras que la expresión de los genes ATF-4, HSPA5 y NOX4 (E-G) se encontró disminuida. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. El valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.](https://static.elsevier.es/multimedia/02149168/0000003700000004/v1_202507071457/S0214916824000895/v1_202507071457/es/main.assets/gr3.jpeg?xkr=u9cfHxSlf6aQSiFvftJPZiYc6DiT8Qbz8RrgAvyMSAeOla8pQcVr/ozhQl1h0rSnIFq279ez23CzjBzlNVOg9hB2BZxUTxaQZ942X0H4aDTNyE2ngg3tkdgsgB6pqVDtIN/d9Q2LPNN5nGyWSoNA4ZPUAbC9QlkbaGq5Ii/pnkLnm8hTPPGseUNHMPg7pq1+8jjTIZ/ofhvh27bL2uo0K2xQTMoS6q7xXBnb2OM74vt41fZSjkas3C9Kq5emJITMxN87Cs0/fyrTO5pJnYBBw5l5o/xNLjaykgzjCSg6eTXSmFtdrcMKJ7ApeN865B7Z)
Expresión génica diferencial de marcadores del estrés del retículo endoplasmático (ERS) y de la subunidad catalítica del complejo NADPH oxidasa en el aneurisma de aorta torácica ascendente (ATAA) de pacientes.
A-D. Los genes EIF2AK3, ERN1, SEL1L y NOX2 se encontraron significativamente aumentados en el grupo de pacientes, mientras que la expresión de los genes ATF-4, HSPA5 y NOX4 (E-G) se encontró disminuida. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. El valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Finalmente, respecto a los genes implicados en la disfunción mitocondrial, y que son indicadores de los procesos de biogénesis mitocondrial y de mitofagia, se encontraron significativamente disminuidos: DNML1, que codifica para la proteína DRP1, implicada en mitofagia; IMMT, MT-CO3, MT-CYB y MT-ND2 (que forman parte del complejo i de la cadena de transporte electrónica mitocondrial), como indicadores de biogénesis mitocondrial; MFF que codifica para el factor de fisión mitocondrial; y la translocasa de la membrana interna mitocondrial TIMM17B, relacionada con mitofagia (fig. 4). La expresión de genes relacionados con estos procesos que, por el contrario, se hallaron aumentados, son el gen TOMM5, que codifica una enzima translocasa de la membrana externa mitocondrial y que está asociada a mitofagia y autofagia y MT-ERF1, que está relacionado con la biogénesis mitocondrial (fig. 4). Tras evaluar la influencia de la edad en la expresión de los genes relacionados con disfunción mitocondrial, únicamente se observó una asociación negativa y estadísticamente significativa para los genes DNM1L y IMMT, con una ß de –0,055 y –0,094, respectivamente (tabla 1 del material suplementario).
![Expresión génica diferencial de marcadores relacionados con la disfunción mitocondrial en el aneurisma de aorta torácica ascendente (AATA) de pacientes. A-G. La expresión de los genes DNML1, IMMT, MFF, MT-CO3, MT-CYB, MT-ND2 y TIMM17B se encontró disminuida significativamente en el grupo de pacientes, mientras que la expresión de los genes MT-ERF1 y TOMM5 (H e I) se encontró aumentada. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. Un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.](https://static.elsevier.es/multimedia/02149168/0000003700000004/v1_202507071457/S0214916824000895/v1_202507071457/es/main.assets/gr4.jpeg?xkr=iu86+5eCWMoTv5XeWHK5K0UGsl0qzUm1M8wNcLSQ2gUaApoC4q5PPNtscFIq0T9IRw1RfO8GBP5ypJZmzW2D5fc/f0eKRJ+GqM6mdT9i5Yg43zzpWzfTlJdYsvF4OmtBUz1KYT0GbwYobgKt/yBXxS+oOmOBfhbjL/ylD31cD6wA+wEMwidTARDiCezJWdswPPVtCcHLtXfTq/lND7/00ci32zLhfVZr9ZKDwzXEeDbKBQpJvXjfvMNZP2qvHfQH6tCoq66i7+qnLrUjFpIgbOC5ImU9ianOCDls/tIyElGlvknkfZmh55cEnYL/hRFU)
Expresión génica diferencial de marcadores relacionados con la disfunción mitocondrial en el aneurisma de aorta torácica ascendente (AATA) de pacientes.
A-G. La expresión de los genes DNML1, IMMT, MFF, MT-CO3, MT-CYB, MT-ND2 y TIMM17B se encontró disminuida significativamente en el grupo de pacientes, mientras que la expresión de los genes MT-ERF1 y TOMM5 (H e I) se encontró aumentada. Los estudios se realizaron en muestras de aorta ascendente de pacientes con AATA (n=13) y controles sanos ([CS] n=6). Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar las diferencias entre grupos. Un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo.
No se encontraron diferencias significativas en la expresión de genes implicados en senescencia celular y vascular en el tejido aórtico entre el grupo de pacientes y controles (fig. 1 del material suplementario).
Análisis bioinformático de los genes regulados diferencialmenteSe realizó un análisis de enriquecimiento de los genes regulados diferencialmente descritos en el apartado anterior mediante ORA usando las bases de datos DisGeNET y OMIM. A partir de este análisis ORA se identificaron los 10 principales procesos patológicos de interés, entre los que se encuentran la rotura de aorta, el aneurisma de aorta, enfermedades de la aorta, enfermedad de Marfan y enfermedad hipertensiva, entre otras (fig. 5A). La figura 5B muestra un diagrama de cuerdas de los 12 genes diferencialmente expresados con la mayor contribución a cada proceso patológico enriquecido.
Análisis de enriquecimiento. Se realizó un análisis de enriquecimiento mediante Over Representing Analysis (ORA) con los genes regulados diferencialmente mostrados en las figuras 2-4, usando las bases de datos DisGeNET y OMIM.
A. Gráfico de círculos con las 10 principales enfermedades identificadas mediante esta estrategia, representadas mediante el análisis ORA con reducción de redundacia k-Medoid. B. Gráfico de cuerdas en el que se muestran los 12 genes con la mayor contribución a cada enfermedad. C. El análisis de interacción proteína-proteína, con un coeficiente de agrupamiento promedio de 0,663 y un valor de p<0,001, mostró interacciones entre las proteínas relacionadas con el remodelado de la MEX, el estrés del RE, el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial. Se distinguieron 3 grupos: el grupo número 1 (en rojo) está relacionado con el proceso de remodelado de la MEX, la integridad de la MEX y la disfunción mitocondrial (coeficiente de agrupamiento promedio: 0,756 y valor p<0,001); el grupo número 2 (en verde) está relacionado con el estrés del RE y la respuesta a las proteínas mal plegadas (coeficiente de agrupamiento promedio: 0,900 y valor de p<0,001); y el grupo número 3 (en azul) está relacionado con la integridad de la membrana mitocondrial con un coeficiente de agrupamiento promedio: 0,667 y un valor de p<0,001. Las líneas de puntos delimitan cada uno de los grupos.
A continuación se llevó a cabo un análisis de IPP a partir de los genes regulados diferencialmente. Se observó que dichas proteínas se agruparon con un coeficiente de agrupamiento promedio de 0,663 y un valor de p<0,001 (fig. 5C). Estas proteínas mostraron interacción en 3 grupos relacionados con el proceso de remodelado de la MEC y la disfunción mitocondrial (1, en rojo), el estrés del RE, la respuesta a la acumulación de proteínas mal plegadas y el estrés oxidativo (2, en verde) y la integridad de la membrana mitocondrial (3, en azul).
DiscusiónLa disección aórtica es la complicación más grave de la enfermedad de la aorta torácica. Aunque la aortopatía torácica es un evento potencialmente mortal, se puede prevenir si las personas en riesgo se identifican a tiempo y son intervenidas mediante cirugía de reparación. La estratificación del riesgo actual se basa únicamente en el diámetro aórtico. Sin embargo, estudios recientes han enfatizado la inexactitud de este parámetro para detectar complicaciones aórticas con antelación a su rotura35,36. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de identificar nuevos marcadores de riesgo y de estrategias de tratamiento para los pacientes con AATA. La identificación de mecanismos patológicos y vías efectoras que conducen a la aortopatía torácica e intervienen en el desarrollo del aneurisma mejoraría significativamente esta estratificación del riesgo de aortopatía individual y, por lo tanto, daría como resultado una mejora importante en el campo de la medicina personalizada.
Este estudio tiene como objetivo desentrañar los mecanismos patogénicos en los aneurismas de la aorta degenerativos no sindrómicos mediante el estudio transcriptómico de la pared aórtica ascendente de pacientes con AATA. En la literatura se han descrito varios mecanismos que contribuyen a la formación de aneurismas aórticos, y entre los más destacados se encuentran las alteraciones en la MEC debido a una síntesis reducida, cambios en su composición y maduración y una degradación acelerada debido a un desequilibrio entre las enzimas proteolíticas y sus inhibidores37–39. Además, se han observado aumentos en las tasas de muerte celular (particularmente de SMC), inflamación vascular, procesos de (trans)diferenciación celular, aterosclerosis y fenómenos de envejecimiento en la pared vascular; aunque muchos de estos datos provienen de estudios en AAA1,11,40,41. Algunos de los fenómenos mencionados anteriormente se han relacionado, al menos en parte, con variantes y mutaciones genéticas12,40. Es importante destacar que la formación de aneurismas parece ser la consecuencia de varios procesos fisiopatológicos independientes, pero que interactúan entre sí41. A pesar de la enorme cantidad de datos, generados principalmente mediante análisis histológicos de muestras de aneurisma, la fisiopatología de la AATA aún está lejos de comprenderse.
Varios genes son fundamentales en el desarrollo de distintas afecciones aneurismáticas, tanto en el caso del AAA como, y esto se ha reconocido en los últimos años, también en los AAT, sobre todo aquellos genes que codifican para enzimas que degradan la MEC, como las MMP y sus inhibidores. Los análisis de expresión génica realizados en nuestro estudio de transcriptómica mostraron que no solo se alteró la expresión de algunas metaloproteinasas, sino también la expresión de proteínas que forman parte de la MEC o que están involucradas en la síntesis y mantenimiento de esta. Así, pudimos detectar cambios en la expresión de genes que codifican componentes de la MEC implicados en la formación de fibras de elastina y colágeno y en su mantenimiento, que se encontraron expresados diferencialmente en el tejido del AATA. Como era de esperar, la expresión de MMP1, 2 y 9 aumentó y esto se vio acompañado por el incremento de la expresión de diferentes colágenos, seguramente como respuesta compensatoria, tal y como ocurre en otras enfermedades aneurismáticas. Además, se observó una disminución de la expresión de los genes que codifican para la elastina y la FBLN5. Cabe destacar que nuestro grupo ha demostrado previamente la disminución de la expresión de FBLN5 en el AAA humano y su implicación en la dilatación aórtica en un modelo experimental42. Como contrapartida, la expresión de la FBN1 aumentó en el AATA de los pacientes, tal vez como mecanismo dirigido a paliar la pérdida y rotura de las fibras elásticas que tiene lugar en esta enfermedad. De hecho, los análisis histológicos confirmaron que la capa media de la aorta aneurismática exhibía una celularidad reducida y que la orientación y la integridad de las fibras elásticas disminuyó mientras que la deposición y desorganización del colágeno aumentó en la pared del AATA. En general, se observó degeneración medial, fragmentación y desorganización de la MEC, pérdida de células del músculo liso vascular y la acumulación de matriz extracelular mucoide en la pared del AATA degenerativo procedente de los pacientes. Todas las características histológicas y la expresión génica diferencial encontradas en el tejido del AATA de nuestra cohorte parecen ser independientes de la diferencia de edad entre los pacientes y los sujetos controles, al no encontrar diferencias de expresión en diversos genes que codifican para proteínas relacionadas con la senescencia vascular43–47.
La búsqueda de terapias que mejoren el manejo de los pacientes con AATA sigue siendo un desafío. En publicaciones previas nosotros y otros grupos hemos demostrado que el estrés del RE y la disfunción mitocondrial tienen un papel clave en la etiopatogenia de los aneurismas de aorta, y que tanto la reducción específica del estrés mitocondrial como la reducción del estrés del RE limitan la progresión del aneurisma y presentan efectos cardioprotectores18–22. A pesar de los destacados avances sobre el papel fisiopatológico de la disfunción mitocondrial y las evidencias de la implicación del ER en el aneurisma de aorta, el conocimiento sobre su implicación en el desarrollo de AATA es limitado29,48–51. En este estudio se muestran las alteraciones encontradas en la expresión de diversos genes que codifican para proteínas implicadas en las vías de respuesta a proteínas mal plegadas y proteínas implicadas en biogénesis, disfunción mitocondrial y mitofagia que aportan nuevas evidencias de la importancia de ambos procesos etiopatogénicos en la pared del aneurisma aorta ascendente degenerativo. El análisis mediante los modelos de regresión determinó que la edad no influye en la expresión diferencial de la mayoría de estos genes. Sin embargo, su contribución relativa al desarrollo de aterosclerosis y/o al de aneurisma de aorta ascendente no puede determinarse, porque tanto el estrés del RE como la disfunción mitocondrial están implicados en la fisiopatología de ambas enfermedades18,21,29,52–55.
En resumen, nuestros datos sugieren que el estrés crónico del retículo endoplasmático y la disfunción mitocondrial pueden contribuir de manera crucial a la aterosclerosis en la pared aórtica y, por lo tanto, promover el inicio y la progresión del AATA. Estos resultados preliminares, que deberán ser validados en una cohorte más amplia, nos permiten postular el bloqueo del estrés del RE y el mantenimiento de la homeostasis mitocondrial mediante la reducción del estrés mitocondrial como intervención terapéutica para frenar el desarrollo del AATA.
FinanciaciónEste trabajo ha sido realizado gracias a la financiación obtenida a través de la Fundación Española de Arteriosclerosis (Beca FEA 2023-Investigación Básica III). Además, el estudio ha contado con financiación del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII; PI20/01004; PI21/01048) y por «FEDER. Una manera de hacer Europa».
Rafael Almendra Pegueros está financiado a través de un contrato PFIS (ISCIII).
AutoríaRafael Almendra Pegueros, Elvira Pérez Marlasca y María Galán procesaron y aislaron el material genético de las muestras humanas, realizaron la histología e interpretaron los resultados de la transcriptómica. Antonio J. Barros Membrilla seleccionó los pacientes y aportó los datos clínicos de los mismos. Josep Julve contribuyó al análisis e interpretación de los datos y la revisión crítica del contenido. José Martínez González contribuyó a la revisión crítica de los resultados. Cristina Rodríguez participó en la concepción y diseño del estudio y la revisión crítica del contenido, María Galán realizó la concepción y diseño del estudio y la redacción del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito y dieron el visto bueno a su versión final.
Conflicto de interesesNo hay conflicto de intereses.
Este trabajo ha sido realizado en el marco del Programa de Doctorado en Farmacología de la Universidad Autónoma de Barcelona.
