Estudo do imprinting genómico em espermatozóides de pacientes com oligozoospermia

No presente trabalho, estudou-se a metilação da DMR do gene H19 através de diversas metodologias moleculares, incluindo a mutação dirigida do DNA pelo bissulfito de sódio, a clonagem de fragmentos de DNA em vectores bacterianos, e a sequenciação do DNA. Foram estudados 69 clones de 5 amostras de espermatozóides isolados de homens com concentração normal de espermatozóides no sémen (≥ 20 x 106/ml) e 31 clones de 2 amostras de espermatozóides isolados de pacientes com oligozoospermia grave (< 5 x106/ml). Verificámos que nos espermatozóides dos pacientes com oligozoospermia grave a larga maioria dos clones apresenta metilação incompleta (26/31, 83,9%), situação contrária ao verificado nos clones dos espermatozóides oriundos das amostras com normozoospermia (33/69, 47,8%). Na oligozoospermia grave, a média de CpG não metiladas foi de 4,1, com uma variação de 1-17 CpG atingidas, enquanto que na normozoospermia a média foi de 0,7 e a variação de 1-3, sendo a diferença entre as médias significativa (p = 0,001). A não metilação de múltiplas CG em simultâneo ocorreu em 5/33 (15,2%) dos clones com défices de metilação no grupo da normozoospermia, enquanto que na oligozoospermia grave a maioria dos casos (19/26, 73,1%) apresentou não metilação associada em simultâneo. Do mesmo modo, por cada posição CpG, a taxa de défice de metilação na normozoospermia foi sempre inferior a 10%, com excepção das CG-6 e 9 (12 e 14%), enquanto que na oligozoospermia grave a maioria dos casos apresentou valores superiores a 20% de não metilação (p = 0,000-0,044). A não metilação completa do local de ligação da proteína CTCF (CpG 4-8) apenas foi encontrada nos casos de oligozoospermia grave (3/31, 9,7%). Em conclusão, os espermatozóides dos pacientes com oligozoospermia grave apresentam taxas elevadas de erros de imprinting genómico, pelo que existe a possibilidade de transmissão desses erros à descendência durante os tratamentos por microinjecção. Na ausência de metilação da DMR do H19, existe a possibilidade de ligação da CTCF ao alelo paterno e consequente transmissão de dois alelos H19 activos e de dois alelos IGF2 inactivos, o que se prevê afectar negativamente o desenvolvimento embrionário in vitro. Os resultados aconselham, por isso, que antes do tratamento da infertilidade por ICSI se peça um estudo do imprinting genómico dos espermatozóides para avaliação do risco.

In the present study, we evaluated the methylation status of H19 gene DMR (Differentially Methylated Region) using sodium bisulphite treatment of DNA, cloning of PCR (Polymerase Chain Reaction) products and automated DNA sequencing. We studied 69 clones from 5 sperm samples obtained from males with normal sperm counts (≥ 20 x 106 Sz/mL) and 31 clones from 2 sperm samples isolated from patients with severe oligozoospermia (< 5 x 106 Sz/mL). In sperm cells from severe oligozoospermic patients, we observed that the majority of clones (26/31, 83.9%) presented incomplete methylation, in contrast to clones obtained from sperm from normozoospermic males (33/69, 47.8%). In severe oligozoospermia, the average of unmethylated CpGs was of 4.1, ranging between 1 to 17 affected CpGs, while in normozoospermia the average was of 0.7, ranging from 1 to 3 affected CpGs, being statistically significant the difference between the two groups (p=0.001). The simultaneous demethylation of multiple CpGs occurred in 5/33 (15.2%) of the clones with incomplete methylation in the normozoospermia group, while in severe oligozoospermia the majority of the cases (19/26, 73.1%) presented associated demethylation simultaneously. Concomitantly, for each CpG position, the level of methylation deficit in normozoospermia was always inferior than 10% with the exception of CpG 6 and 9 (12 and 14%, respectively), while in severe oligozoospermia the majority of cases presented values of demethylation superior than 20% (P = 0.000-0.044). The complete demethylation of CTCF protein binding site (CpG 4-8) was only found in severe oligozoospermic cases (3/31, 9.7%). In conclusion, sperm from severe oligozoospermic patients present high rates of genomic imprinting errors, leading to the possibility of transmission of these errors to the offspring during ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) treatments. In the absence of methylation at H19 DMR, CTCF protein might bind to the paternal allele and, consequently, promote the transmission of two active H19 and two inactive IGF2 alleles. This situation could negatively affect the in vitro development of preimplantation embryo. Thus, these results suggest the importance of a previous study of genomic imprinting in sperm before the ICSI procedure, in order to evaluate the existence of any risk.