Las diferentes técnicas de aislamiento permiten recuperar hongos en función de su capacidad para utilizar o no un determinado sustrato. La técnica de espolvoreado es un método para la recuperación de hongos nematófagos del suelo. Estos hongos son predadores naturales de los nematodos y están ampliamente distribuidos en la naturaleza.
ObjetivosDetectar hongos con posible capacidad nematófaga en suelos de parques de la ciudad de Corrientes (Argentina).
MétodosLas muestras de tierra fueron tomadas eligiendo al azar una zona del suelo entre dos árboles, desechando la hojarasca y a no más de 2cm de profundidad. El aislamiento se realizó según la técnica de espolvoreado utilizando huevos de Toxocara canis como anzuelo.
ResultadosSe recogieron 18 muestras de suelo, de las que se aislaron 6 géneros y 8 especies de hongos. El método del espolvoreado, simple y eficiente, tiene la ventaja de utilizar una pequeña cantidad de suelo sin tratamiento y permite aislar hongos que pueden crecer sobre huevos de geohelmintos. Este estudio permitió recuperar hongos de los géneros Bipolaris, Fusarium, Purpureocillium, Curvularia, Phoma y Scytalidium.
ConclusionesNo se ha encontrado bibliografía de los géneros Curvularia, Phoma y Scytalidium que describa la interacción de estos hongos con huevos de nematodos y queda, por tanto, el desafío de investigar cuál es su verdadera acción sobre estos huevos.
The use of different isolation techniques allows the recovery of fungi based on their ability to use selective substrates. The sprinkle method is a technique for the recovery of nematophagous fungi in the soil. These fungi are natural predators of nematodes and are widely distributed in nature.
AimsTo detect possible fungi with nematophagous ability in the soil of city parks in Corrientes (Argentina).
MethodsThe soil samples were taken from an area of ground between two trees and to no more than 2cm deep. The isolation was performed according to the sprinkle method with Toxocara canis eggs as bait.
ResultsEighteen soil samples were collected, and 6 genera and 8 species of fungi were isolated. The sprinkle method, simple and efficient, has the advantage of using a small amount of untreated soil for the isolation of fungi that can grow on the eggs of geohelminths. The genera Bipolaris, Fusarium, Purpureocillium, Curvularia, Phoma and Scytalidium were isolated in this study.
ConclusionsNo other studies describing the interaction between the genera Curvularia, Phoma and Scytalidium with nematode eggs have been found in the literature, thus more studies are required to determine what is their real action on these eggs.
El suelo, como ecosistema, constituye un hábitat complejo y heterogéneo que alberga una gran riqueza de especies vegetales, animales y microbianas, lo que hace de él un ambiente apropiado para el desarrollo de microorganismos tanto eucariotas (algas, hongos y protozoos) como procariotas (bacterias y arqueas). La interrelación de estos organismos es muy variada y compleja, y su distribución no es al azar, sino que sigue patrones espaciales de agregación20.
Los procedimientos clásicos para estudiar los hongos del suelo se basan en cultivos in vitro que implican el aislamiento de conidias o hifas activas, y su crecimiento en un medio de cultivo axénico para su posterior identificación y cuantificación22.
El uso de diferentes técnicas de aislamiento permite recuperar los hongos en función de su capacidad para utilizar o no un determinado sustrato. La técnica selectiva de espolvoreado (soil sprinkling method) es un método simple y efectivo para la recuperación de hongos nematófagos del suelo. Esta técnica fue diseñada por Duddington en 1955, con Panagrellus redivivus L, nematodo de vida libre, como señuelo para estimular el crecimiento de los hongos2. Gortari et al.16 adaptaron la técnica utilizando como anzuelo huevos de Toxocara canis, y así poder recuperar aquellos hongos con capacidad para desarrollarse sobre los huevos de estos nematodos, cuya cubierta es muy diferente a la de los estadios larvarios o a la de los gusanos adultos.
Los hongos nematófagos son predadores naturales de los nematodos, aunque algunos tienen predilección por los huevos y larvas de los geohelmintos a los que parasitan y destruyen12. Estos hongos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, pudiéndose aislar una diversidad de especies de diferentes ecosistemas. Algunos investigadores han estudiado la influencia de factores ambientales en su distribución para poder establecer si los hongos nematófagos son ubicuos o si están limitados a un hábitat en particular16.
El objetivo de este trabajo fue detectar hongos con posible capacidad nematófaga en suelos de plazas de la ciudad de Corrientes (Argentina) mediante el método de espolvoreado con huevos de T. canis como anzuelo.
Materiales y métodosÁrea de muestreoEl muestreo se realizó en plazas del casco céntrico de la ciudad de Corrientes, Argentina (27°28'S-58°49’O). Esta ciudad es la capital de la provincia homónima y está situada a 52m sobre el nivel del mar, a orillas del río Paraná. Su clima es subtropical sin estación seca. La humedad relativa media anual es del 72%. La temperatura media anual es de 21,5°C, con temperaturas extremas de 45°C en verano y −4°C en invierno. Su régimen de lluvias es regular, con precipitaciones que van de 950 a 1.400mm anuales25. El casco céntrico de la ciudad cuenta con cinco plazas clásicas; las cuatro restantes son de menor tamaño. Las primeras son de planta cuadrada, tienen una superficie de una hectárea, y poseen una frondosa y añosa arboleda con sendas peatonales y lugares de juego y de recreo para niños. Las plazas de menor tamaño son de planta irregular, con arboleda, sendas peatonales y lugares de juego y de recreo acordes al tamaño de la misma. Algunas son sede de vendedores ambulantes, kioscos, locales de comida rápida y semanalmente se instala la feria municipal de forma alternada. En todos los casos, se convierten en pulmones de la ciudad junto con las avenidas y bulevares24.
Muestras de tierraLas muestras de tierra fueron tomadas de acuerdo con la metodología utilizada por Ciarmela et al.9, con la elección al azar de una zona del suelo entre dos árboles, desechando la hojarasca y a no más de 2cm de profundidad. Las muestras fueron colocadas en bolsas de papel estériles y conservadas en refrigeración hasta su procesamiento. El muestreo se realizó en la primavera del año 2011 y en el otoño de 2012, con la toma de una muestra de tierra por parque y por momento del año.
Aislamiento fúngico e identificación de los hongosPara el aislamiento de los hongos que pudieran estar presentes en las muestras de tierra se utilizó la técnica selectiva de espolvoreado, siguiendo los pasos de Gortari et al.16, que utilizan huevos de T. canis como anzuelo, con la variante de que las placas fueron incubadas a temperatura ambiente sin estar envueltas en bolsas plásticas, y el tiempo de la primera observación fue reducido a 14 días. Cada muestra de tierra fue procesada por duplicado. Cuando se observó el desarrollo de hongos sobre los huevos, se procedió al aislamiento de los mismos con subcultivos en agar patata-cloranfenicol. Para determinar la identidad de los hongos se utilizaron diversas obras5,10,11,13–15,23,26,28–30.
Resultados y discusiónDe las 18 muestras se aislaron, por desarrollo sobre los huevos de T. canis, 44 cepas. Las mismas se clasificaron en 6 géneros y 8 especies (tabla 1).
Géneros y especies que crecieron sobre los huevos de Toxocara canis
| Géneros y especies | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | Número de cepas | % |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Bipolaris australiensis | Xx | x | 3 | 6,8 | |||||||
| Curvularia clavata | X | x | X | Xx | x | 6 | 14,6 | ||||
| Curvularia lunata | X | x | x | x | Xx | Xx | 8 | 18,2 | |||
| Curvularia pallescens | x | 1 | 2,3 | ||||||||
| Fusarium chlamydosporum | X | X | X | 3 | 6,8 | ||||||
| Purpureocillium lilacinus | Xx | x | X | xx | X | X | 8 | 18,2 | |||
| Phoma sp. | x | x | x | x | 4 | 9 | |||||
| Scytalidium sp. | Xx | Xx | x | x | x | Xx | Xx | 11 | 24,1 | ||
| Total | 44 | 100 |
X: otoño; x: primavera.
El método del espolvoreado, simple y eficiente, tiene la ventaja de que al utilizar una pequeña cantidad de suelo sin tratamiento, brinda una información que es representativa de la mayoría de los hongos nematófagos presentes2. Asimismo, permite aislar hongos que pueden crecer sobre huevos de geohelmintos; esto permitió cumplir con el objetivo del presente trabajo, al demostrarse la presencia de hongos con actividad antagónica sobre huevos de T. canis en el suelo de plazas de la ciudad de Corrientes.
Pocos autores han usado el método del espolvoreado. Lýsek et al.19 utilizaron como señuelo huevos de Ascaris lumbricoides, que permitieron aislar de varias regiones de Cuba hongos de los géneros Cunninghamella, Fusarium, Gliocladium, Humicola, Mortierella, Paecilomyces, Penicillium y Verticillium. En Costa Rica, Soto-Barrientos et al.27, con el uso de tres métodos para el aislamiento del suelo de hongos nematófagos, obtuvieron con la técnica del espolvoreado el 83% de los aislamientos; tres especies de Arthrobotrys, y los géneros Candelabrella, Trichoderma, Beauveria, Clonostachys y Lecanicillium fueron los organismos aislados. En Argentina, Gortari et al.16 lograron aislar Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humicola, Mortierella, Mucor, Paecilomyces y Penicillium con la técnica del espolvoreado y huevos de T. canis. Finalmente, de Souza Maia Filho et al.12, en Río Grande del Sur (Brasil), con el mismo señuelo que Gortari et al.16, recuperaron cepas de Aspergillus, Acremonium, Bipolaris, Fusarium, Gliocladium, Mucor y Trichoderma.
Nuestro estudio nos permitió recuperar 6 géneros, de los cuales 3, Bipolaris, Fusarium y Purpureocillium, fueron hallados también por los autores nombrados anteriormente, y 3 géneros (Curvularia, Phoma y Scytalidium) no se habían encontrado hasta ahora parasitando o interaccionando con huevos de nematodos.
Respecto a los cambios introducidos en la técnica de Gortari, cabe aclarar que por ser Corrientes una ciudad más húmeda y calurosa que La Plata (Argentina), las incubaciones no se realizaron en bolsas plásticas: debido a las condiciones climáticas se generaba una alta concentración de humedad dentro de las placas. El otro cambio fue acortar el tiempo de observación de los cultivos, ya que en 3 semanas el crecimiento era tal que no permitía distinguir los huevos de T. canis, ni tampoco si había desarrollo fúngico sobre ellos. Cuando la temperatura era templada la primera observación se realizó a los 14 días, y cuando superaba los 28°C, a partir del día 7.
Purpureocillium lilacinus, también aislado en otros estudios, es una de las especies que se halló con mayor frecuencia en este trabajo. Este hongo tiene una reconocida acción sobre los huevos de T. canis1,3,4,7,17. Dentro del género Fusarium, varias especies han sido citadas como antagonistas de huevos de T. canis: Fusarium oxysporum, Fusarium sulphureum, Fusarium moniliforme, Fusarium pallidoroseum y Fusarium solani8,12,16. La presencia de Fusarium chlamydosporum ampliaría el espectro de especies de este género con capacidad ovicida. El género Curvularia representó, con tres especies, el 34% de los aislamientos. Este género es conocido por su capacidad celulolítica y queratinolítica como patógeno de vegetales y de animales, respectivamente6,21. No se han encontrado referencias de su actividad sobre huevos de T. canis ni de otros geohelmintos. Sin embargo, su desarrollo sobre los huevos fue frecuente y abundante (fig. 1).
Los hongos considerados tradicionalmente como coelomicetos son un vasto y heterogéneo grupo de taxa dispersos en numerosos y variados nichos ecológicos, tales como suelo, desechos orgánicos o agua. Asimismo, pueden ser parásitos de hongos, líquenes, plantas, insectos y vertebrados, actuando unas veces como simbiontes y otras como patógenos18,23. Los géneros Scytalidium y Phoma, que aparecieron con asiduidad en este estudio, están incluidos en este grupo. De ellos tampoco se han encontrado informes relacionados con su actividad sobre huevos de T. canis o de otros geohelmintos.
Los hongos de este estudio cuya capacidad ovicida no se conoce dejan el desafío de investigar cuál es su verdadera acción sobre los huevos de los nematodos.
El interés de conocer la presencia de hongos nematófagos en distintos lugares radica en que uno de los factores que condiciona el desarrollo y permanencia de los huevos de helmintos en el suelo es su destrucción por organismos antagónicos, como son los hongos. Este informe es un aporte al conocimiento de la distribución de aquellos hongos que pueden crecer sobre huevos de geohelmintos para, a partir de ello, evaluar su acción sobre los mismos.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener conflicto de intereses.
Los autores agradecen a la Secretaría General de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional del Nordeste el apoyo económico, y a la Sra. Liliana Alegre su asistencia en la preparación de materiales.
