En Chile no se conoce la frecuencia del determinante plasmídico de resistencia a quinolonas (DPRQ) aac(6′)-Ib-cr en cepas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli productoras de BLEE.
MetodologíaUtilizando PCR, RFLP y secuenciación se detectó aac(6′)-Ib y aac(6′)-Ib-cr en cepas aisladas en 10 hospitales chilenos entre 2008 y 2009.
ResultadosEste DPRQ fue detectado ampliamente en K. pneumoniae (54%) y E. coli (74%). La CIM50 de CIP fue mayor en cepas con aac(6’)-Ib-cr; 8 veces en K. pneumoniae y 4 en E. coli. En 13 cepas de K. pneumoniae y 3 de E. coli se encontraron ambos genes simultáneamente.
ConclusiónEste es el primer informe de aac(6’)-Ib-cr en cepas de K. pneumoniae y E. coli productoras de BLEE aisladas en hospitales chilenos distribuidos en una extensión geográfica superior a 2.800km.
The frequency of aac(6′)-Ib-cr gene in ESBL-producing strains of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli is unknown, in Chile.
MethodologyThe aac(6′)-Ib and aac(6’)-Ib-cr genes were investigated using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP), and sequencing, in strains isolated from 10 Chilean hospitals between 2008-2009.
ResultsThe aac(6’)-Ib-cr gene was detected in 54% of K. pneumoniae and 74% of E. coli strains. The CIM50 of CIP was higher among strains harboring aac(6’)-Ib-cr, 8 times higher in K. pneumoniae and 4 times higher in E. coli. Moreover, both aac(6’)-Ib and aac(6’)-Ib-cr were simultaneously found in 13 K. pneumoniae and 3 E. coli isolates.
ConclusionThis is the first report of aac(6’)-Ib-cr in ESBL-producing strains of K. pneumoniae and E. coli isolated from in-patients in Chilean hospitals located along an area of more than 2,800Km.
Se han descrito diversos determinantes plasmídicos de resistencia a quinolonas (DPRQ) que disminuyen la susceptibilidad a estos compuestos, facilitando la selección de mutantes resistentes de alto nivel1. Entre los DPRQ descritos en enterobacterias a nivel mundial y en Latinoamérica1-3 se encuentran: las proteínas Qnr (QnrA, S, B, C y D), las bombas de expulsión QepA y OqxAB y la variante de la aminoglucósido acetil transferasa AAC(6’)-Ib, denominada AAC(6′)-Ib-cr, capaz de acetilar ciprofloxacino y norfloxacino, además de amikacina, tobramicina y kanamicina. Considerando que en Chile no existe información de la presencia de AAC(6′)-Ib-cr en cepas hospitalarias de enterobacterias, el objetivo de este trabajo fue determinar su frecuencia en cepas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli productoras de BLEE.
MetodologíaCepas bacterianas. Se incluyeron 100 cepas de E. coli y 100 cepas de K. pneumoniae resistentes a ácido nalidíxico y/o resistentes o con susceptibilidad intermedia a ciprofloxacino aisladas durante los años 2008-2009 en 10 hospitales de Chile. Todas correspondieron a aislados únicos de muestras clínicas de pacientes con al menos 48h de hospitalización. Los hospitales están localizados en las ciudades de Iquique, Antofagasta, Valparaíso, Santiago, Concepción, Temuco y Puerto Montt.
Determinación del nivel de resistencia a quinolonas. Se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) de ciprofloxacino (CIP), levofloxacino (LVX) y ácido nalidíxico (NAL) mediante el método de dilución seriada en agar, utilizando los puntos de corte del CLSI (2010)4. Las cepas E. coli ATCC 25922 y Enterococcus faecalis ATCC 29212 fueron incluidas como cepas controles.
Detección de aac(6′)-Ib-cr. Se amplificó por PCR un fragmento intragénico del gen aac(6′)-Ib (482 pb), de acuerdo a las condiciones descritas previamente5. Para identificar el gen aac(6′)-Ib-cr se realizó RFLP con la enzima BseGI [BtsCI] (Fermentas Life Sciences, EE.UU.), ya que en esta variante se genera un sitio de restricción para esta enzima, obteniéndose dos productos de 272 y 210pb.
Secuenciación de productos de amplificación. Los amplicones fueron secuenciados en Macrogen Corp (Rockville, EE.UU.).
Análisis estadístico. Para buscar correlaciones estadísticamente significativas entre la presencia del gen aac(6¿)-Ib-cr y la CIM a ciprofloxacino se utilizó el test exacto de Fisher.
ResultadosLa prevalencia del gen aac(6′)-Ib-cr fue del 54% en las cepas de K. pneumoniae y del 74% en E. coli. Cabe destacar que del total de cepas en las cuales fue detectado aac(6′)-Ib, el gen aac(6′)-Ib-cr correspondió al 66,7% (54/81) en las cepas de K. pneumoniae y al 94,9% (74/78) en las cepas de E. coli. Estos resultados fueron confirmados por secuenciación y análisis de los amplicones respectivos, detectando las sustituciones Asp179Tyr y Trp102Arg, características de esta variante enzimática. Por otra parte, el gen aac(6′)-Ib-cr fue detectado en cepas de todos los hospitales de diferentes ciudades a lo largo de Chile. Además, en 13 cepas de K. pneumoniae y 3 cepas de E. coli se obtuvo una digestión incompleta (patrón de restricción con 3 bandas), evidenciando la presencia simultánea de aac(6′)-Ib y aac(6′)-Ib-cr (fig. 1).
En la tabla 1 se presenta la CMI50 de NAL, CIP y LVX en cepas de K. pneumoniae y E. coli con y sin el gen aac(6′)-Ib-cr. Se observa que tanto en cepas de E. coli como en cepas de K. pneumoniae, que presentaron la variante AAC(6′)-Ib-cr, los valores de CIM50 de CIP fueron mayores, comparados con los del grupo de cepas en las que aac(6′)-Ib-cr estaba ausente, siendo 8 veces superior en K. pneumoniae y 4 en E. coli. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas, con un valor de p<0,05, tanto para E. coli como para K. pneumoniae.
Actividad de quinolonas sobre cepas de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli con y sin el DPRQ aac(6’)-Ib-cr aisladas en hospitales de Chile, 2008-2009
| Especie bacteriana | aac(6’)-lb-cr | Ácido nalidíxico | Ciprofloxacino | Levofloxacino | ||||||
| Rango | CIM50 | %R | Rango | CIM50* | %R | Rango | CIM50 | %R | ||
| K. pneumoniae | +(54)a | 2-> 1.024 | 1.024 | 87 | < 0,0625-> 64 | 64 | 70,4 | < 0,0625-128 | 16 | 72,2 |
| –(46) | 2-> 1.024 | 64 | 52,2 | < 0,0625-> 64 | 8 | 52,2 | < 0,0625-128 | 16 | 52,2 | |
| E. coli | + (74) | 2-> 1.024 | 1.024 | 96 | < 0,0625-> 128 | > 128 | 96 | < 0,0625-64 | 16 | 94 |
| –(26) | 2-> 1.024 | 1.024 | 65,4 | < 0,0625-> 128 | 32 | 57,7 | < 0,0625-64 | 8 | 53,8 | |
CIM: concentración inhibitoria mínima (μg/ml); % R: porcentaje de cepas resistentes.
En Chile y otros países latinoamericanos ha aumentado el consumo de quinolonas, lo que ha favorecido la selección y la diseminación de cepas resistentes a estos compuestos6-8. Diversos estudios informan que cepas de E. coli y K. pneumoniae productoras de BLEE frecuentemente presentan un fenotipo de multirresistencia, que incluye quinolonas, en comparación a cepas no productoras de BLEE9. Es interesante la alta frecuencia de cepas chilenas con aac(6′)-Ib-cr, especialmente en cepas de E. coli. Park et al.5 informan que en cepas aisladas entre 1999 y 2004, E. coli presentó mayor frecuencia de este DPRQ, señalando que existiría una distribución de especie, cuya razón se desconoce. Esto demuestra que aac(6′)-Ib-cr ha estado presente durante un período de tiempo prolongado, a pesar de no ser detectado, permitiendo su amplia diseminación. Este mismo fenómeno podría ocurrir en cepas chilenas, ya que Díaz et al.10, trabajando con cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, aisladas entre 1997 y 2003, informó una alta frecuencia del gen aac(6′)-Ib (69%), pero no analizó si corresponden a aac(6′)-Ib-cr. Es posible que este DPRQ hubiese estado presente en esos años y el aumento en el uso de quinolonas en los últimos años en Chile10 podría haber generado una rápida selección de cepas con esta variante, lo que explicaría la elevada prevalencia de aac(6′)-Ib-cr en E. coli y K. pneumoniae aisladas casi una década después. Por otra parte, aac(6′)-Ib-cr se detectó en cepas de todas las ciudades desde donde provenían las muestras, abarcando una extensión de 2.869km. Esta extensa diseminación estaría favorecida por la localización de estos DPRQ en elementos genéticos móviles1,3, que a su vez portan otros determinantes de resistencia, en especial relacionados con genes blaCTX-M-14, blaCTX-M-24 y blaSHV-121,3. Este estudio evidenció una relación entre aac(6′)-Ib-cr y blaCTX-M del grupo 2 en K. pneumoniae y blaCTX-M del grupo 1 en E. coli. Además, se destaca el hallazgo de cepas que portan aac(6′)-Ib y aac(6′)-Ib-cr, simultáneamente. Los resultados permiten enfatizar que la selección de cepas que portan una combinación de genes de resistencia en los hospitales chilenos constituye una seria amenaza desde el punto de vista clínico, haciendo necesario mantener una activa vigilancia que estime la prevalencia de estos mecanismos de resistencia, como también evitar su selección y diseminación.
FinanciaciónEste estudio fue realizado con financiamiento otorgado por la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción (DIUC 207.036.032-1.0 2007-7881-40).
Conflicto de interesesLos autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.
Agradecemos la colaboración de los microbiólogos de los centros hospitalarios de Iquique (O.López, P.Choque), Antofagasta (C.Mardones y C.Rojas), Valparaíso (G.Peralta), Santiago (M.Cifuentes, B.Barraza, M.Vechiola, S.Bravo, A.Sakurada, J.C.Valenzuela, J.C.Román y C.Gárate), Concepción (N.Enríquez, H.Chabouty, M.Sandoval y M.Pérez), Temuco (A.Anderson, V.Illesca y P.Reydet) y Puerto Montt (M.L.Rioseco y A.Mella).
