Incorporación del test de dispersión de la cromatina espermática al laboratorio andrológico

Resumen

Objetivo

Desarrollar y poner a punto la técnica de dispersión de la cromatina espermática (SCD) para evaluar el grado de fragmentación del ADN en semen.

Materiales y métodos

Se incluyeron 57 pacientes normozoospérmicos (OMS 2010), los cuales fueron invitados a participar del estudio luego de firmar los consentimientos correspondientes. Se evaluó el grado de fragmentación mediante técnica de SCD, de manera objetiva y subjetiva, en muestras sometidas a estrés oxidativo con H₂O₂ y seleccionadas mediante swim up o gradiente de densidad, así como congeladas y descongeladas.

Resultados

La evaluación objetiva demuestra que la menor fragmentación se asociaría a un mayor tamaño del halo por definición, aunque se observa un aumento (p < 0,05) en el tamaño del núcleo. El tratamiento oxidante (> 100 μM de H₂O₂) aumenta el índice de fragmentación de forma dosis-dependiente sin afectar la viabilidad ni la motilidad espermática. Las técnicas de selección de espermatozoides mótiles evaluadas (swim up o gradiente de densidad) disminuyen el índice de fragmentación, aunque se observa cierta susceptibilidad individual. La congelación directa a –20 °C permite diferir la realización del test, independientemente del tipo de muestra.

Conclusión

La evaluación subjetiva de la técnica SCD es suficiente para su uso en el laboratorio clínico, siempre que se evalúe la relación halo/núcleo para la clasificación. La utilización del tratamiento oxidante permite introducir un control positivo de daño para la puesta a punto de la técnica. La selección espermática mediante técnicas de uso habitual en reproducción asistida disminuye el índice de fragmentación, observándose cierta susceptibilidad individual. La técnica SCD puede ser diferida mediante congelamiento de la muestra, lo que permite un ahorro de insumos, reactivos y tiempo de procesamiento.

Abstract

Objective

To develop the sperm chromatin dispersion test (SCD) for evaluating the DNA fragmentation in semen.

Materials and methods

57 normozoospermic (WHO 2010) patients were invited to participate in the study after signing the consents. DNA fragmentation was evaluated by SCD, objectively and subjectively, after oxidative stress with H₂O₂ and also in motile selected samples (swim up or density gradient), as well as in frozen and thawed samples.

Results

The objective assessment showed that minor fragmentation is associated to a larger halo size by definition, but also a significant increase in the size of the nucleus is observed. Oxidizing treatment (> 100 μM of H₂O₂) increases the fragmentation index in a dose-depend way without affecting sperm viability and motility. Different techniques of motile sperm selection (swim up or density gradients) decrease the fragmentation index with an individual susceptibility. Regardless of the sample (semen, suspension or post swim up direct freezing to –20 °C allows to delay the test.

Conclusion

Subjective evaluation of the SCD test is sufficient for the clinical laboratory, evaluating the relation halo/nucleoid for the classification. To set up the SCD a dose-response curve with oxidizing treatment is required as a positive control of damage. The use of sperm selection methods used in assisted reproduction, decreases the fragmentation index, however individual susceptibility was observed. The SCD could be delayed by freezing the sample which allows saving of reagents and processing time.