Comparación entre el test de fragmentación de ADN espermático mediante la técnica de SCD y el índice de vitalidad medida con el test de naranja de acridina

Introducción: La integridad del ADN espermático es uno de los factores más importantes que se analizan actualmente en el estudio de fertilidad masculina. Hay numerosas publicaciones sobre la utilidad de diversos métodos en los cuales se analiza el estado de la cromatina espermática. Uno de los más sencillos es el test de bromuro de etidio y naranja de acridina (AO), con el cual se comprueba el grado de desnaturalización del ADN espermático en función de su unión al colorante naranja de acridina. Sin embargo, la técnica de AO está limitada a estas propiedades metacromáticas, por cuanto nos aporta información limitada del estatus nuclear del espermatozoide. Otras técnicas, como el sperm chromatin dispersion (SCD) analizan la fragmentación del ADN espermático comprobando roturas en la cadena. Objetivo: En nuestro estudio se intenta observar si hay correlación entre la vitalidad del espermatozoide mediante el test vital de AO-bromuro de etidio con la fragmentación del ADN medida mediante el test SCD. En ambos casos se trata de un sistema visual de análisis. Material y métodos: Para el estudio se han incluido 82 muestras de semen de varones en estudio de fertilidad en la Clínica Tambre. Para la vitalidad se ha empleado el test de bromuro de etidio AO y para la fragmentación espermática el test SCD (Halosperm, Halotech). La técnica de AO detecta la proporción de espermatozoides muertos dependiendo del grado de desnaturalización del ADN nuclear. Espermatozoides con fluorescencia naranja indican un ADN desnaturalizado, mientras que los que presentan fluorescencia verde contienen el ADN intacto. El porcentaje de fragmentación se midió mediante el test SCD mejorado (Halosperm). Este test nos indica la presencia de roturas de la cadena de ADN basándonos en el tamaño del halo obtenido. En un espermatozoide fragmentado no observaremos este halo al analizar la muestra con microscopio de fluorescencia y el fluorocromo GelRed y, por el contrario, un espermatozoide con el ADN no fragmentado presenta un halo mayor. Se utilizó la t de Student para comparación estática de medias entre ambos grupos. Se ha considerado como significativo un valor de p < 0,05. Resultados: La proporción de espermatozoides con ADN desnaturalizado detectado con el test de AO se correlacionó significativamente con la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado, detectado con el test SCD (r = 0,5; p < 0,001). El valor medio del índice de vitalidad con AO fue de 20,93% (6 ± 50) frente al 28,35% (7,3 ± 40) de índice de fragmentación en las 82 muestras analizadas. Además, también se correlaciona positivamente el valor de los espermatozoides con ADN fragmentado o desnaturalizado con la movilidad. Por otra parte, los 2 ensayos mostraron una correlación estadísticamente negativa con la concentración espermática. Discusión: Este estudio demuestra la correlación entre los resultados de vitalidad espermática medida con el test de AO y el grado de fragmentación de ADN con el SCD. Estos resultados sugieren que podría utilizarse el test de AO como primera opción para determinar el daño espermático de la cromatina antes de la realización de tests más costosos o complicados.

Introduction: Sperm DNA integrity is one of the most important factors currently analyzed in the study of male fertility. There are numerous publications on the utility of diverse methods analyzing sperm chromatin status. One of the simplest is the ethidium bromide/acridine orange (AO) test, which assesses the degree of sperm DNA denaturation according to its binding to acridine orange staining. However, the AO test is limited to these metachromatic properties and consequently provides limited information on the nuclear status of the sperm. Other techniques, such as the sperm chromatin dispersion (SCD) test, analyze sperm DNA fragmentation by assessing DNA strand breaks. Objective: To analyze whether there is a correlation between sperm vitality measured through the ethidium bromide/AO test and DNA fragmentation measured through the SCD test. In both cases, the samples were analyzed visually. Material and methods: Eighty-two semen samples from men undergoing fertility testing in the Clínica Tambre were included in this study. The ethidium bromide/AO test was used to test sperm vitality and the SCD test (Halosperm, Halotech) was used to evaluate sperm DNA fragmentation. The AO technique detects the proportion of dead sperm, depending on the degree of nuclear DNA denaturation. Sperm with orange fluorescence indicate denatured DNA, while those with green fluorescence contain intact DNA. The percentage of fragmentation was measured by the improved SCD test (Halosperm). This test indicates DNA strand breaks based on the size of the halo obtained. In fragmented sperm, no halo is observed when the sample is examined with a fluorescence microscope and GelRed fluorochrome. Sperm with intact DNA show a halo. Student's t-test was used to compare the means between the two groups. Differences of p<0.05 were considered statistically significant. Results: The proportion of sperm with denatured DNA detected with the AO test was significantly correlated with the proportion of sperm DNA fragmentation detected with the SCD test (r = 0.5, P < 0.001). In the 82 samples analyzed, the mean vitality index with the AO test was 20.93% (6 ± 50) versus 28.35% (7.3 ± 40) for the fragmentation index. The proportion of sperm with denatured or fragmented DNA was also positively correlated with motility. The two assays showed a statistically significant negative correlation with sperm concentration. Discussion: This study demonstrates a correlation between the results of sperm vitality measured by the AO test and the degree of DNA fragmentation measured by the SCD test. These results suggest that the AO test could be the first option to determine sperm chromatin damage before more expensive or complicated tests are performed.