Characterization of embryonic stem-like cells derived from mouse spermatogonial stem cells following low-intensity ultrasound treatment

Abstract

Objective

Spermatogonial stem cells (SSCs) are able to form embryonic stem-like cells (ES-like cells) and embryonic bodies (EBs). Low-intensity ultrasound stimulation (LIUS) has positive effects on the growth and differentiation of the different cells. In this study, we tried to investigate the effects of LIUS on SSC differentiation to ES-like cells.

Materials and methods

SSCs were isolated from neonatal mice and their identification was confirmed by tracking of PLZF, Oct-4, and C-Kit proteins. The SSCs and Sertoli cells were co-cultured in DMEM/F12 supplemented with 15% FBS and LIF. SSCs stimulated by LIUS with 200 mW/CM² intensity. Characterization of obtained ES-like cells was confirmed with Sox2, Oct-4, and SSEA-1 immunofluorescence staining. Also, real-time PCR was performed to analyse the expression of c-Myc and Nanog genes in ES-Like Cells and Stra8, Piwil2 and Plzf genes in SSCs after 21 days of the in vitro culture.

Results

Our results showed c-Kit, PLZF and Oct-4 proteins were expressed positively in SSCs and Sox2, Oct-4, SSEA-1 in the ES-like cells by immunocytochemistry. The results of flow cytometry showed a significant increase in expression of c-Myc and Nanog in ES-like cells compared to SSCs (p < .05), whereas the Stra8, Piwil2, and Plzf became down-regulated during 21 days of culture. ES-like markers cell SSEA-1, Sox2 and Oct-4 were increased in the LIUS group compared to the control group (p < .05).

Conclusion

The results indicated that ES-like cells with pluripotency characteristics were derived from SSCs.

Resumen

Objetivo

Las células madre espermatogoniales (SSC) pueden formar células embrionarias de tipo madre (células similares a ES) y estructura de cuerpos embrionarios (EB). La estimulación por ultrasonido de baja intensidad (LIUS) tiene efectos positivos sobre el crecimiento y la diferenciación de las diversas células. En este estudio, tratamos de investigar los efectos de LIUS en la colonización y la viabilidad de células similares a ES.

Materiales y métodos

Las SSC se aislaron de ratones neonatales y su identificación se confirmó mediante el seguimiento de las proteínas PLZF, Oct-4 y c-kit. Las SSC y las células de Sertoli se cultivaron conjuntamente en DMEM/F12 suplementado con 15% de FBS y LIF. Las SSC estimuladas por LIUS continúan con una intensidad de 200 mW/cm². La caracterización de las células similares a ES obtenidas, se confirmó con tinción con inmunofluorescencia Sox2, Oct-4 y SSEA-1. Además, se realizó una PCR en tiempo real para analizar la expresión de los genes c-Myc y Nanog en células similares a ES y genes Stra8, Piwil2 y Plzf en SSC, después de 21 días de cultivo in vitro.

Resultados

Nuestros resultados mostraron que las proteínas c-kit, PLZF y Oct-4 se expresaron positivamente en SSC y Sox2, Oct-4, SSEA-1, en las células similares a ES por inmunocitoquímica. Los resultados de la citometría de flujo mostraron un aumento significativo en la expresión de c-Myc y Nanog en células similares a ES, en comparación con las SSC (p < 0,05), mientras que Stra8, Piwil2 y Plzf disminuyeron en 21 días. Las células marcadoras similares a ES, SSEA-1, Sox2 y Oct-4 se incrementaron en el grupo LIUS, en comparación con el grupo control (p < 0,05).

Conclusión

Los resultados indicaron que las células similares a ES, con características de pluripotencia, se derivaron de las SSC.