DOCTORANDA: C. C. MÉNDEZ DAVILA
DIRECTORES: C. DE LA PIEDRA GORDO Y A. RAPADO ERRAZTI
CALIFICACION: SOBRESALIENTE CUM LAUDE
FECHA DE LECTURA: 24 DE MAYO DE 2001
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA. FACULTAD DE MEDICINA.
UNIVERSIDAD AUTONOMA. MADRID.
En este trabajo nos planteamos los siguientes objetivos:
1) Utilizar el cultivo primario de osteoblastos humanos procedentes de hueso trabecular de mujeres postmenopáusicas como modelo experimental para el estudio de la interacción del 17ß-estradiol (ES), y 2 moduladores selectivos de los receptores estrogénicos, tamoxifeno (TA) y raloxifeno (RA), sobre la actividad remodeladora ósea.
2) Estudiar el efecto del ES 108M, TA 108M y RA 10-8M sobre la proliferación celular y la síntesis de colágeno en osteoblastos humanos en cultivo.
3) Estudiar los efectos producidos por el ES 108M, el TA 10-8M y el RA 108 sobre la expresión génica y la síntesis de la interleucina 6 (IL-6) tanto constitutiva como estimulada por la interleucina 1β (IL-1β) en osteoblastos humanos en cultivo.
Para ello, los osteoblastos se obtuvieron de hueso trabecular de mujeres postmenopáusicas sanas, entre 55 y 75 años de edad. Las células se cultivaron según el método descrito por Nacher et al, y se caracterizaron utilizando la síntesis de osteocalcina y de fosfatasa alcalina como marcadores que permiten identificar las células como osteoblastos. Los experimentos se realizaron siempre con células entre el segundo y quinto pase.
Los osteoblastos en confluencia fueron mantenidos durante 24 horas en medio de cultivo DMEM sin rojo de fenol y sin suero fetal, con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1%. Entonces, se añadieron ES 108M (Sigma), TA 10-8M (Zeneca), RA 108M (Lilly) o vehículo (etanol) con o sin IL-1β. Después de 24 horas se determinaron los niveles de IL-6 y de propéptido aminoterminal de procolágeno I (PINP) en el medio de cultivo. La proliferación celular fue medida a través de un ensayo metabólico y de contaje celular a las 48 y a las 96 horas de incubación.
Para estudiar la expresión de IL-6, las células fueron cultivadas hasta la confluencia en placas Petri. El medio fue reemplazado por DMEM libre de rojo de fenol y de suero, con BSA al 0,1%. Después de 24 horas las células fueron tratadas con ES 108M, TA 108M o RA 108M durante 1, 2, 3 y 6 horas, o durante 3 horas con cada uno de estos agentes e IL-1β simultáneamente. Los niveles de mARN fueron evaluados a través de la transcripción reversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Se coamplificó el gen humano de la gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) como control de un gen constitutivo.
Los hallazgos obtenidos en las condiciones experimentales utilizadas son los siguientes:
El cultivo primario de osteoblastos humanos procedente de hueso trabecular de mujeres postmenopáusicas constituye un modelo experimental útil y reproducible para el estudio de las interacciones entre el ES 108M, TA 108M y RA 108M y las células formadoras de hueso.
Las observaciones morfológicas y las propiedades funcionales expresadas por las células humanas en estudio permiten identificarlas como osteoblastos.
La adición de ES 108M, TA 108M y RA 108M produjo un aumento significativo en la proliferación celular de osteoblastos humanos en cultivo a las 48 y 96 horas, con respecto a las células controles (sin adición de estímulo).
La adición de ES 108M, TA 108M yRA 108M no produjo ninguna variación significativa sobre la síntesis de colágeno por los osteoblastos medida a través de los niveles del PINP.
El ES 108M, TA 108M y RA 108M no produjeron una disminución en los niveles constitutivos de IL-6 en el medio de cultivo de osteoblastos humanos. Estos fármacos no produjeron tampoco un descenso en el incremento de la síntesis de IL-6 mediado por la adición de IL-1β al medio de cultivo.
El ES 108M, TA 108M y RA 108M no produjeron ninguna variación significativa sobre la expresión constitutiva del mARN de la IL-6, ni sobre el incremento de expresión producido por la IL-1β en osteoblatos humanos en cultivo.
Las beneficiosas acciones del 17β-estradiol, tamoxifeno y raloxifeno demostradas sobre la masa ósea parecen no estar mediadas a través de un descenso de la liberación de la IL-6, agente favorecedor de la resorción ósea, sino posiblemente a través de otros factores liberados por los osteoblastos que actuarían sobre la actividad osteoclástica o por acciones directas del estradiol, raloxifeno o tamoxifeno sobre los osteoclastos.