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Vol. 9. Núm. 4.
Páginas 231-242 (Octubre - Diciembre 2017)
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Vol. 9. Núm. 4.
Páginas 231-242 (Octubre - Diciembre 2017)
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DOI: 10.1016/j.neuarg.2017.07.001
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Diagnóstico de las enfermedades mitocondriales: utilidad de un abordaje clínico-molecular sistematizado incorporando secuenciación de alto rendimiento
Diagnosis of mitochondrial diseases: Utility of a clinical-molecular approach systemized incorporating high performance sequencing
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Julieta Rosalesa,
Autor para correspondencia
Julietarosales1987@gmail.com

Autor para correspondencia.
, Nancy Medinaa, Nerina Martíneza, Sergio Rodríguez-Quirogaa,c, Marta Córdobaa,b, Cecilia Vazquez-Dusefantea, Patricia Vegaa, Ana Lía Taratutod, Marcelo Andrés Kauffmana,b, Dolores González-Moróna
a Consultorio de Neurogenética, Centro Universitario de Neurología «José María Ramos Mejía», División Neurología. Hospital J.M. Ramos Mejía, Facultad de Medicina, UBA, Buenos Aires, Argentina
b Instituto de Investigaciones en Medicina Traslacional-CONICET, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Austral, Buenos Aires, Argentina
c Área de Trastornos del Movimiento, Centro Universitario de Neurología «José María Ramos Mejía», División Neurología, Hospital J.M. Ramos Mejía, Facultad de Medicina, UBA, Buenos Aires, Argentina
d Neuropatología, FLENI, Buenos Aires, Argentina
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Tabla 1. Características demográficas y modelos de herencia presentes en nuestra cohorte
Tabla 2. Caracterización clínica de nuestra cohorte
Tabla 3. Detalle de los pacientes en los que fue identificado un defecto molecular y su presentación fenotípica. Referencias:
Tabla 4. Frecuencia de defectos moleculares en nuestra corte
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Resumen
Introducción y objetivos

Las enfermedades mitocondriales comprenden un conjunto de trastornos multisistémicos que afectan al normal funcionamiento de la maquinaria energética celular. Su diagnóstico acabado requiere de una aproximación que, además de un alto índice de sospecha, involucre distintas técnicas de biología molecular y una cuidadosa selección del tejido a estudiar. Con un objetivo general de evaluación de su abordaje diagnóstico, exploramos la utilidad de un nuevo algoritmo diagnóstico y estandarizamos herramientas moleculares necesarias para su implementación.

Material y métodos

Se realizó un estudio prospectivo, analítico y observacional en una cohorte de 73 pacientes con sospecha de desorden mitocondrial, asistidos en nuestro centro en el período comprendido entre mayo del 2008 y junio del 2016. Pusimos a punto desarrollos diagnósticos moleculares que incluyeron técnicas clásicas monogénicas y novedosas genómicas de alto rendimiento.

Resultados

Caracterizamos las manifestaciones neurológicas y extraneurológicas de nuestra cohorte; 61 pacientes fueron clasificados en síndromes mitocondriales clásicos, siendo LHON, MELAS y CPEO los más frecuentes. Siguiendo el algoritmo propuesto, obtuvimos un rendimiento diagnóstico molecular de un 51%, pudiendo identificar alteraciones en 37 pacientes. Mutaciones puntuales en el ADNmt fueron individualizadas en 30 pacientes, alteraciones estructurales en el genoma mitocondrial en 3 y mutaciones en genes nucleares en 4.

Conclusiones

Nuestros resultados confirman la utilidad del algoritmo propuesto utilizado y de las herramientas moleculares empleadas, manifestado en un alto rendimiento diagnóstico. Esto resulta de gran valor para una asistencia médica más eficiente e integral de los pacientes y familias afectados por desórdenes mitocondriales.

Palabras clave:
Enfermedades mitocondriales
Genética
Fenotipo
Algoritmo
Diagnóstico
Abstract
Introduction and objectives

Mitochondrial diseases encompass a group of multi-systemic disorders affecting the normal function of the cellular energetic machine. Diagnosis requires an approach that, in addition to a high index of suspicion, involves molecular techniques and a careful selection of the tissue to be studied. With an overall objective assessment and diagnostic approach, we explored the utility of a new algorithm and standardized the molecular diagnostic tools needed for its implementation.

Material and methods

A prospective, analytical, observational study was conducted in a cohort of 73 patients with suspected mitochondrial disorder who were treated at our hospital between May 2008 and June 2016. We developed molecular diagnostic tools that included classical monogenic techniques and novel high-performance genomic techniques.

Results

We characterized the neurological and extra-neurological manifestations noted in our cohort. 61 patients were classified into classical mitochondrial syndromes, being LHON, MELAS and CPEO the most frequent. Following the proposed algorithm, we obtained a molecular diagnostic performance of 51%, identifying mutations in 37 patients. DNAmt mutations were identified in 30 patients. Structural rearrangements in mitochondrial genome were found in three and four in nuclear genes, respectively.

Conclusions

Our results confirm the utility of the proposed algorithm and the molecular tools used, as evidenced by a high diagnostic performance. This is of great value to a more efficient and comprehensive medical care of patients and families affected by mitochondrial disorders.

Keywords:
Mitochondrial diseases
Genetics
Phenotype
Algorithm
Diagnosis
Texto completo
Introducción

Las enfermedades mitocondriales comprenden un conjunto de trastornos multisistémicos que afectan al normal funcionamiento de la maquinaria energética celular. Dado que las proteínas pertenecientes a los procesos de la cadena respiratoria y fosforilación oxidativa (CR/OXPHOS) son codificadas por 2 genomas diferentes e independientes (ADN mitocondrial [ADNmt] y ADN nuclear [ADNn]); este grupo de enfermedades pueden deberse a mutaciones en cualquiera de ellos y seguir un modelo de herencia mitocondrial o mendeliano. Además, el ADNmt puede verse afectado por grandes rearreglos estructurales (deleciones parciales o duplicaciones), generalmente responsables de síndromes de presentación esporádica. Sumando complejidad, tanto las mutaciones puntuales del ADNmt como los grandes rearreglos suelen ser heteroplásmicos (cualidad dada por coexistencia de ADNmt salvaje y mutado en una mitocondria, célula o tejido) y cada tejido presenta un umbral de expresión clínica diferente1. Todo esto lleva a la necesidad de implementar distintas técnicas de biología molecular y una cuidadosa selección del tejido a estudiar a fin de incrementar la chance de identificar un defecto causal en las enfermedades mitocondriales1.

Con respecto a la presentación clínica, es característico su amplio pleomorfismo, pudiendo ser diagnóstico diferencial de diversos trastornos neurológicos y extraneurológicos. En consecuencia, su diagnóstico requiere de un alto índice de sospecha. Existen múltiples algoritmos propuestos, tanto a nivel local2 como a nivel internacional3-5. Sin embargo, estos deben ser actualizados teniendo en cuenta la disponibilidad de nuevas técnicas de secuenciación (como la secuenciación de alto rendimiento conocida como NGS por sus siglas en inglés) y el mayor acceso a las pruebas moleculares en general. Por otro lado, existe escasa experiencia local en esta población de pacientes en Argentina. Comprendiendo a la enfermedad mitocondrial como una patología genética, su diagnóstico no concluye hasta la detección de la mutación patogénica, lo cual excede los fines diagnósticos y la consejería genética, sino que implica el reconocimiento de posibles blancos terapéuticos objeto de ulteriores desarrollos.

En este trabajo, nuestro objetivo general es evaluar el abordaje diagnóstico de los desórdenes mitocondriales con manifestaciones en el sistema nervioso haciendo uso de una aproximación estandarizada, tanto en términos clínicos como moleculares. Para ello, como objetivos específicos nos proponemos:

  • Explorar la utilidad de un nuevo algoritmo diagnóstico de enfermedades mitocondriales.

  • Estandarizar herramientas de diagnóstico molecular necesarias para la implementación del mismo.

  • Ilustrar mediante casos representativos el pleomorfismo fenotípico y la utilidad de dichas herramientas en el diagnóstico de enfermedades mitocondriales.

Pacientes y métodosPacientes. Tipo de Estudio. Algoritmo diagnóstico

Se realizó un estudio prospectivo, analítico y observacional en una cohorte de 64 pacientes con sospecha de desorden mitocondrial asistidos en nuestro centro en el período comprendido entre mayo del 2008 y junio del 2016. Todos los pacientes brindaron consentimiento informado mediante formulario aprobado por el Comité de Ética institucional previamente a su participación en el estudio. En todos los casos se recabó información demográfica, familiar, clínica y paraclínica. En cada uno de los pacientes se siguió un enfoque diagnóstico basado en 3 etapas, modificado de una propuesta previa de uno de los autores de este trabajo2. Este algoritmo es presentado en la figura 1. Brevemente, consiste en etapas sucesivas de caracterización y direccionamiento de procedimientos diagnósticos orientados a la individualización del defecto molecular etiopatogénico. El primer paso consiste en determinar cuál es la probabilidad de que el paciente tenga una enfermedad mitocondrial. Se seleccionó la escala de Wolf6 para estratificar esta probabilidad mediante la sumatoria de signos y síntomas y de los hallazgos en pruebas bioquímicas e histopatológicas (fig. 2). En el segundo paso se determina si tiene presentación fenotípica correspondiente a un síndrome clásico o no (MELAS, MERRF, CPEO, Leigh, SANDOS, etc.). Si el paciente presenta un fenotipo clásico se realiza la búsqueda de mutaciones puntuales y/o alteraciones estructurales en el ADNmt (2-10kb) o la secuenciación de genes nucleares candidatos como C10orf2 o POLG, según corresponda. En caso de que estos estudios resulten negativos, se continúa con la secuenciación de exoma completo y/o de genoma mitocondrial, según pudiera indicar el patrón de herencia observado en la familia estudiada y evaluada en el paso 3.

Figura 1.

Algoritmo de selección de estudios moleculares para el diagnóstico etiopatogénico de la enfermedad mitocondrial.

(0,36MB).
Figura 2.

Criterios de probabilidad de disfunción mitocondrial a partir de datos clínicos y de estudios complementarios. Modificada de Wolf et al.6.

(0,38MB).
Estudios moleculares

Se obtuvo de cada paciente 5ml de sangre entera por venopuntura y en casos seleccionados se obtuvo tejido muscular mediante biopsia. Las muestras se conservaron codificadas a –20 °C y/o nitrógeno hasta su posterior procesamiento. Se purificó luego ADN genómico total utilizando sistemas comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante. Este fue conservado anonimizado hasta su posterior procesamiento. A partir de la direccionalidad propuesta por el algoritmo utilizado pudieron realizarse distintas pruebas de diagnóstico molecular, a saber:

  • 1)

    Búsqueda de mutaciones puntuales en el ADNmt: se amplificaron fragmentos flanqueantes a regiones del genoma mitocondrial donde se localizan mutaciones causantes de síndromes clásicos (p. ej., 3.243, 8.344, 8.993, etc.) por PCR. Luego los amplificados purificados fueron secuenciados por método de Sanger. Detalles particulares de cada reacción individual están disponibles para ser requeridos a los autores.

  • 2)

    Secuenciación completa del genoma mitocondrial: se obtuvo la secuencia completa del genoma mitocondrial mediante enriquecimiento por Long Range PCR (LR-PCR) y NGS en sistemas GS-FLX 454 e Ilumina Miseq como se describe en Kauffman et al.7.

  • 3)

    Detección de alteraciones estructurales (deleciones/duplicaciones) del ADNmt: se amplificaron por LR-PCR 3 fragmentos, que solapados abarcan en su totalidad el ADNmt. Los productos obtenidos fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 0,9% para evaluar visualmente la presencia de deleciones o duplicaciones en el ADNmt.

  • 4)

    Búsqueda de mutaciones puntuales en el ADNn: se amplificaron fragmentos flanqueantes a regiones del genoma nuclear donde se localizan mutaciones causantes en genes nucleares de síndromes clásicos (p. ej., C10orf2, POLG, etc.) por PCR. Luego los amplificados purificados fueron secuenciados por método de Sanger. Detalles particulares de cada reacción individual están disponibles para ser requeridos a los autores.

  • 5)

    Secuenciación completa del exoma humano: a partir de 1 μg de ADN se construyó una biblioteca de secuenciación mediante fragmentación de la muestra por nebulización en tamaños de 350-400 pb. Posteriormente, se enriqueció la biblioteca con aquellos fragmentos representativos del exoma humano completo mediante la utilización de un sistema de hibridación en solución (Nimblegen V3). Se amplificaron por PCR todos los fragmentos seleccionados y finalmente, se secuenció el exoma utilizando un equipo Illumina Hiseq 2000. Además de identificarse variantes en el genoma nuclear, se extrajo secuencia del genoma mitocondrial e se identificaron variantes en el mismo siguiendo procedimientos descriptos en Picardi et al.8.

Análisis bioinformático

Se utilizaron las siguientes herramientas bioinformáticas para la caracterización de las secuencias obtenidas e inferencia de patogenicidad: ENSEMBL9, MUTATION @A GLANCE10, SIFT11, POLYPHEN212, MUTATION TASTER13,14, gsMapper (Roche®), Tablet15, MITOMAP16 y PHYLOTREE17. Para el procesamiento y análisis de los exomas se utilizaron procedimientos desarrollados por nuestro grupo y descriptos en Cordoba et al.18.

Análisis estadístico

Las distintas herramientas bioinformáticas utilizadas involucran el uso de algoritmos particulares que incluyen pruebas estadísticas que habitualmente son no paramétricas y basadas en permutaciones. Una descripción detallada de cada algoritmo puede encontrarse en cada una de las referencias de las herramientas mencionadas arriba.

ResultadosCohorte

Entre mayo del 2008 y junio del 2016 se incluyó en este estudio a un total de 73 pacientes con sospecha de desorden mitocondrial, de los cuales 39 fueron esporádicos, mientras que 34 presentaban antecedentes en la familia de trastornos similares (mitocondrial: 27 pacientes, mendeliana AD: 7 pacientes). Hubo una similar representación de sexos, donde 38 fueron mujeres. La edad promedio de inicio de los síntomas fue de 22 años, con un mínimo de 3 meses y un máximo de 59 años (tabla 1). Sesenta y un pacientes presentaron fenotipo compatible con un síndrome mitocondrial clásico, el más frecuente fue LHON (24 pacientes), seguido de CPEO (17 pacientes), MELAS (7 pacientes), CPEO Plus (4 pacientes), KSS (3 pacientes), MERRF (3 pacientes), Leigh (2 paciente) y SANDOS (un paciente) (tabla 1 y tabla 2).

Tabla 1.

Características demográficas y modelos de herencia presentes en nuestra cohorte

Número total de pacientes  73 
Género
Masculino  35 
Femenino  38 
Sitio de defecto molecular
ADN nuclear 
ADN mitocondrial  66 
Edad de inicio de los síntomas (años)  22 (0,3-59) 
Tabla 2.

Caracterización clínica de nuestra cohorte

N.°  AF  Sexo  Edad de inicio, años  Sitio de defecto molecular  Fenotipo  Mutación  Síntomas neurológicos  Síntomas extraneurológicos 
No  44  ADN mit  MELAS  3243A>G  Epilepsia, miopatía, ptosis, stroke like, hipoacusia  Intolerancia a la glucosa 
Sí  35  ADN mit  Fenotipo no clásico  8344A>G  Miopatía   
Sí  11  ADN mit  MERRF  8344A>G  Epilepsia, mioclonías   
Sí  45  ADN mit  Fenotipo no clásico  sin diagnóstico  Mioclonías   
Sí  40  ADN nuclear  CPEO  1001G>A  Ptosis, oftalmoparesia  Hipoacusia 
Sí  30  ADN nuclear  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis  Hipoacusia 
No  ADN mit  KSS  Deleción común  Ptosis, oftalmoparesia, Rp, miopatía, ataxia  Hipoacusia 
No  19  ADN mit  CPEO  Deleción común  Ptosis, oftalmoparesia, hipoacusia  Hipoacusia 
No  15  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Epilepsia, hipoacusia, ataxia, atrofia NO   
10  No  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia   
11  No  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia, hipoacusia  Hipoacusia 
12  No  15  ADN mit  LHON  3460G>A  NO   
13  Sí  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía   
14  Sí  40  ADN mit  MERRF  Sin diagnóstico  Miopatía, lipoma   
15  No  18  ADN mit  LHON  11778G>A  NO  Hipoacusia, arritmia, intolerancia a la glucosa 
16  Sí  35  ADN mit  LHON  3460G>A  NO   
17  Sí  22  ADN mit  LHON  3460G>A  NO  Hipoacusia, baja talla, arritmia 
18  Sí  35  ADN mit  LHON  3460G>A  NO   
19  Sí  56  ADN nuclear  CPEO  c.907C>T  Ptosis   
20  Sí  20  ADN nuclear  CPEO  c. 907 C>T  Ptosis   
21  Sí  39  ADN nuclear  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, bulbar   
22  No  26  ADN mit  LHON  11778 G>A  NO  Miocardiopatía 
23  No  ADN mit  Leigh  Sin diagnóstico  Encefalopatía, distonía, neuropatía   
24  No  50  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Miopatía   
25  No  29  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
26  No  ADN mit  MELAS  3243A>G  Epilepsia, stroke like, encefalopatía, ataxia   
27  No  28  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis ofltalmoparesia, miopatía   
28  No  ADN mit  CPEO Plus  Sin diagnóstico  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía, bulbar   
29  Sí  17  ADN mit  CPEO plus  3243A>G  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía, bulbar, neuropatía  Hipoacusia, arritmia, intolerancia glucosa 
30  Sí  10  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia   
31  No  0.5  ADN mit  Leigh  8993T>G  Encefalopatía mitocondrial   
32  No  ADN mit  MERRF  8344A>G  Miopatía, lipoma, ataxia, neuropatía   
33  No  16  ADN mit  LHON  3460G>A  NO   
34  Sí  ADN mit  MELAS  Sin diagnóstico  Encefalopatía, hipoacusia, convulsiones, stroke like, miopatía   
35  Sí  31  ADN mit  MELAS  3243A>G  Cefalea, stroke like, epilepsia   
36  Sí  59  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Hipoacusia  DBT, miocardiopatía 
37  Sí  ADN mit  MELAS  3243A>G  Encefalopatía mitocondrial   
38  Sí  10  ADN mit  Fenotipo no clásico  3243A>G  Intolerancia a la glucosa  Intolerancia a la glucosa 
39  Sí  20  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
40  Sí  30  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
41  No  0.3  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Encefalopatía   
42  No  28  ADN mit  SANDOS  Sin diagnóstico  Ataxia asensorial, neuropatía, hipoacusia, miopatía, bulbar, neuropatía  Hipoacusia 
43  No  50  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia   
44  Sí  11  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Miopatía, hipoacusia  Hipoacusia 
45  Sí  18  ADN mit  MELAS  3243A>G  Ptosis, epilepsia, encefalopatía, hipoacusia, miopatía  Hipoacusia 
46  Sí  17  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia, ataxia   
47  Sí  10  ADN mit  CPEO  Deleción común  Ptosis, miopatía proximal   
48  No  ADN mit  Fenotipo no clásico  sin diagnóstico  Encefalopatía, RP  Hipoacusia, baja talla, arritmia 
49  Sí  ADN mit  LHON  Sin diagnóstico  NO   
50  Sí  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Miopatía, neuropatía, encefalopatía   
51  Sí  ADN mit  KSS  Sin diagnóstico  Encefalopatía, miopatía, ptosis, ofltalmoparesia, piramidalismo, ataxia   
52  No  40  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía  Hipoacusia, baja talla, arritmia 
53  No  12  ADN mit  CPEO plus  Sin diagnóstico  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía, epilepsia   
54  No  12  ADN mit  KSS  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia, ataxia  Hipoacusia, baja talla, arritmia 
55  No  21  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
56  Sí  21  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
57  Sí  38  ADN mit  LHON  Sin diagnóstico  NO   
58  Sí  31  ADN mit  Fenotipo no clásico  Sin diagnóstico  Miopatía proximal, ptosis, ataxia, neuropatía   
59  Sí  31  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia, miopatía proximal  Miocardiopatía 
60  Sí  39  ADN mit  MELAS  Sin diagnóstico  Stroke like,   
61  No  19  ADN mit  LHON  3460G>A  NO   
62  Sí  30  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
63  Sí  18  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
64  Sí  22  ADN nuclear  CPEO plus  Sin diagnóstico  Ptosis, miopatía proximal, bulbar   
65  No  33  ADN mit  LHON  Sin diagnóstico  NO   
66  Sí  19  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
67  No  25  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
68  No  26  ADN mit  LHON  14484T>C  NO   
69  No  33  ADN mit  LHON  Sin diagnóstico  NO   
70  Sí  20  ADN nuclear  CPEO  c.1433T>G  Ptosis, oftalmoparesia, miopatía proximal   
71  No  26  ADN mit  LHON  Sin diagnóstico  NO   
72  No  22  ADN mit  LHON  11778G>A  NO   
73  No  35  ADN mit  CPEO  Sin diagnóstico  Ptosis, oftalmoparesia, miopatía proximal   

AD: autosómico dominante; CPEO: Chronic progressive external ophthalmoplegia; KSS: Kearns-Sayre syndrome; LHON: Leber hereditary optic neuropathy; MELAS: Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes; MERRF: Myoclonic Epilepsy Associated with Ragged Red Fibers; NO: neuropatía óptica.

Manifestaciones clínicas

La manifestación neurológica más frecuente fue la debilidad muscular en miembros (26 pacientes), seguida de neuropatía óptica bilateral (25 pacientes), ptosis-oftalmoparesia (21 pacientes), encefalopatía (11 pacientes), ptosis aislada (9 pacientes), epilepsia (9 pacientes), ataxia (8 pacientes), episodios stroke like (5 pacientes), neuropatía (5 pacientes), disfagia con otros síntomas bulbares (4 pacientes), mioclonías (3 pacientes), retinopatía pigmentaria (2 pacientes), y con mucho menos frecuencia cefalea y distonía en un paciente, respectivamente. Entre las manifestaciones extraneurológicas se incluye la sordera neurosensorial bilateral en 16 pacientes, las arritmias (6 pacientes), la intolerancia a la glucosa (5 pacientes), las cardiomiopatías (4 pacientes), los lipomas (2 pacientes), baja talla (un paciente) y hepatopatía en un paciente (tabla 2).

Rendimiento diagnóstico molecular

Siguiendo el algoritmo propuesto, obtuvimos un rendimiento diagnóstico molecular de un 51%, pudiendo identificar alteraciones en 37 pacientes. Mutaciones puntuales en el ADNmt fueron individualizadas en 30 pacientes. Alteraciones estructurales en el genoma mitocondrial en 3 y mutaciones en genes nucleares en 4 (tablas 3 y 4).

Tabla 3.

Detalle de los pacientes en los que fue identificado un defecto molecular y su presentación fenotípica. Referencias:

N.°  AF  Sexo  Edad de inicio, años  Fenotipo  Síntomas neurológicos  Mutación 
No  44  MELAS  Epilepsia, miopatía, ptosis, stroke like, hipoacusia  NC_012920:m.3243A>G 
Sí  35  Fenotipo no clásico  Miopatía  NC_012920:m.8344A>G 
3a  Sí  11  MERRF  Epilepsia, mioclonías  NC_012920:m.8344A>G 
Sí  40  CPEO  Ptosis, oftalmoparesia  NM_021830·4 (C10orf2) c.1001G>A (p.Arg334Gln) 
No  KSS  Ptosis, oftalmoparesia, Rp, miopatía, ataxia  m.8482_13460del4977 
No  19  CPEO  Ptosis, oftalmoparesia, hipoacusia  m.8482_13460del4977 
No  15  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
No  18  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
Sí  35  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
10b  Sí  22  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
11b  Sí  35  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
12  Sí  56  CPEO  Ptosis  NM_021830·4 (C10orf2) c.907C>T (p.Arg303Trp) 
13c  Sí  20  CPEO  Ptosis  NM_021830·4 (C10orf2) c.907C>T (p.Arg303Trp) 
14  No  26  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
15  No  29  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
16  No  MELAS  Epilepsia, Stroke like, Encefalopatía, ataxia  NC_012920:m.3243A>G 
17  Sí  17  CPEO plus  Ptosis, ofltalmoparesia, miopatía, bulbar, neuropatía  NC_012920:m.3243A>G 
18  No  6 meses  Leigh  Encefalopatía mitocondrial  NC_012920:m.8993T>G 
19  No  MERRF  Miopatía, lipoma, ataxia, neuropatía  NC_012920:m.8344A>G 
20  No  16  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
21  Sí  31  MELAS  Cefalea, Stroke like, epilepsia  NC_012920:m.3243A>G 
22  Sí  MELAS  Encefalopatía mitocondrial  NC_012920:m.3243A>G 
23d  Sí  10  Fenotipo no clásico  Intolerancia a la glucosa  NC_012920:m.3243A>G 
24  Sí  20  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
25e  Sí  30  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
26  Sí  18  MELAS  Ptosis, epilepsia, encefalopatía, hipoacusia, miopatía  NC_012920:m.3243A>G 
27  Sí  10  CPEO  Ptosis, miopatía proximal  m.8470_13446del14977 
28  No  21  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
29  Sí  21  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
30  No  19  LHON  NO  NC_012920:m.3460G>A 
31  Sí  30  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
32  Sí  18  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
33  Sí  19  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
34  No  25  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
35  No  26  LHON  NO  NC_012920:m.14484T>C 
36  No  23  LHON  NO  NC_012920:m.11778G>A 
37  Sí  20  CPEO  Ptosis, oftalmoparesia, miopatía proximal  NM_021830.4 (C10orf2) c.1433T>G; p.F478C 
a

Familiar de paciente 2.

b

Familiar de paciente 9.

c

Familiar de paciente 12.

d

Familiar de paciente 22.

e

Familiar de paciente 24.

Tabla 4.

Frecuencia de defectos moleculares en nuestra corte

Mutaciones del ADN mitocondrial  33 
11778 G>A  12 
3243A>G 
3460G>A 
8344A>G 
Deleción común (m.8482_13460del4977) 
14484G>A 
8993T>G 
Mutaciones del ADN nuclear 
C10orf2 
Total de mutaciones  37 
Casos ilustrativos

Se describen 2 casos clínicos que creemos relevantes porque compartiendo una misma mutación presentan fenotipos bien diferentes, siendo ilustrativos del pleomorfismo clínico de las enfermedades mitocondriales, su dificultad diagnóstica y la necesidad de herramientas moleculares para su diagnóstico.

Caso 1. Paciente de 34 años, sin antecedentes personales de relevancia, que comenzó a los 17 años con ptosis palpebral bilateral y oftalmoparesia de curso lentamente progresivo. A los 30 años agregó debilidad proximal de 4 miembros y trastornos fonodeglutorios. Su historia familiar era relevante por la presencia de ptosis bilateral en su madre y hermana.

En el examen físico presentaba ptosis palpebral bilateral 2/3, oftalmoparesia moderada, voz nasal. Hipoacusia bilateral. Debilidad proximal de 4 miembros leve (Kendall 3-4/5). Sensibilidad conservada. Normorreflexia generalizada. Los exámenes complementarios confirmaron además la presencia de: hipoacusia neurosensorial, intolerancia a la glucosa, trastorno de la conducción supraventricular cardiaca, aumento de creatincinasa y ácido láctico en sangre. El fenotipo fue interpretado como compatible con CPEO Plus.

Se realizó biopsia de músculo, la cual evidenció alto porcentaje de FRR, Cox deficientes. Se realizó secuenciación por Sanger de ADNmt, hallándose la mutación para NC_012920:m.3243A>G tanto en sangre periférica como en músculo, por lo que se infiere un alto nivel de heteroplasmia (fig. 3).

Figura 3.

Caso 1. A) Familigrama. B) Secuenciación por Sanger en sangre periférica y en músculo evidenciando mutación NC_012920:m.3243.

(0,16MB).

Caso 2. Paciente de 26 años, sin antecedentes personales o familiares de relevancia; comenzó a los 8 años con trastornos del aprendizaje, 12 años después agregó ataxia de tronco con lateropulsión a derecha, trastornos conductuales e intolerancia al ejercicio. A los 25 años presentó disartria y hemianopsia homónima derecha asociada a crisis comicial focal motora en el miembro superior derecho. Se le realizó RM de cerebro que evidenció lesión córtico-subcortical parietotemporooccipital izquierda con restricción en difusión, la cual remitió espontáneamente y en forma completa al mes, por lo que se interpretó como episodio «stroke like».

En el examen físico presentaba MiniMental State Examination de 23/30, hipoacusia bilateral, dismetría apendicular de 4 miembros de predominio derecho. Los exámenes complementarios confirmaron además la presencia de: hipoacusia neurosensorial y aumento de ácido láctico en sangre y líquido cefalorraquídeo. El fenotipo fue interpretado como compatible con MELAS.

Se realizó biopsia de músculo, la cual evidenció un alto porcentaje de FRR, Cox deficientes. Se realizó secuenciación por Sanger de ADNmt que puso de manifiesto también en este caso la mutación NC_012920:m.3243A>G en músculo. Se suspendió el ácido valproico y se rotó medicación antiepiléptica a levetiracetam con buen control de la crisis (fig. 4).

Figura 4.

Caso 1 A) Familigrama. B) Secuenciación por Sanger en músculo evidenciando mutación NC_012920:m.3243.

(0,11MB).
Discusión

En el presente trabajo pudimos caracterizar una población adulta de pacientes argentinos con enfermedad mitocondrial implementando un algoritmo propio que pretende ordenar la aproximación diagnóstica, comenzando con un score de probabilidad de etiología mitocondrial del trastorno, siguiendo por una caracterización sindrómica y finalizando con el diagnóstico molecular.

Hasta donde sabemos, esta es la serie más grande reportada en Argentina que incluye datos clínicos y moleculares, estos últimos obtenidos a través del desarrollo propio de diferentes metodologías que incorporan el estudio de genoma mitocondrial y de exoma completo mediante NGS.

A pesar de que las enfermedades mitocondriales se caracterizan por un marcado pleomorfismo clínico y una escasa correlación fenotipo-genotipo1, pudimos identificar el defecto causal en 37 pacientes. Nuestros resultados confirman la utilidad del algoritmo diagnóstico propuesto expresada en un alto rendimiento diagnóstico (51%), que deriva en mejor costo-efectividad. A modo de ejemplo, a través de la secuenciación de exoma completo por NGS y extracción del genoma mitocondrial utilizando un pipeline especializado fue posible la identificación de una mutación en el ADNmt no sospechada previamente por el fenotipo en una niña con presentación en forma de síndrome no clásico. La utilización de NGS y LR-PCR nos permitió aumentar la tasa diagnóstica comparando con nuestros propios resultados obtenidos previamente utilizando solamente secuenciación dirigida de fragmento único mediante método de Sanger19.

Si bien existen otras series reportadas en la literatura, un gran número de ellas analizaron muestras infantiles, por lo que las manifestaciones clínicas más frecuentes incluyeron encefalopatía y trastornos del aprendizaje, seguidas de debilidad muscular20. Nuestra serie difiere en la inclusión mayoritaria de adultos con un rango de edad más grande, siendo más frecuente la presentación sindromática clásica que la no clásica, con un predominio de LHON, CPEO y MELAS. Distintos artículos publicados a lo largo de toda una década revelaron una dicotomía molecular entre adultos y niños, en la que los niños frecuentemente portan trastornos autosómicos recesivos debidos a defectos del ADNn, mientras que los defectos del ADNmt se presentan más frecuentemente en la edad adulta21,22. En los últimos años esta separación se ha puesto en revisión, a la luz de que las mutaciones nucleares con herencia mendeliana pueden ocurrir frecuentemente también en adultos. De ahí la importancia de aportar conocimiento científico en este grupo etario incluyendo el estudio de genes mitocondriales del genoma nuclear, tal como hicimos en nuestro trabajo23.

Los avances en el diagnóstico molecular de las enfermedades mitocondriales han permitido dilucidar nuevos mecanismos en el desarrollo de los fenotipos clínicos que pueden estar vinculados a la función primaria de la proteína mutada, a la acumulación secundaria de deleciones y mutaciones puntuales o a la depleción del ADNmt. Esto abre las puertas a nuevas terapéuticas orientadas a prevenir y reparar los daños del ADNmt, que podrían ser aplicadas en distintas etapas de la enfermedad23.

Concluimos que una aproximación ordenada y sistematizada, como la que proponemos, permite confirmar el diagnóstico molecular en un porcentaje alto de pacientes. Esto resulta de gran valor para una mejor comprensión de la patogénesis de las enfermedades neurogenéticas y para una asistencia médica más eficiente e integral de los pacientes y sus familias.

Responsabilidades éticasProtección de personas y animales

Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.

Confidencialidad de los datos

Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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