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Vol. 38. Núm. S1.
Páginas 32-38 (Enero 2020)
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Vol. 38. Núm. S1.
Páginas 32-38 (Enero 2020)
DOI: 10.1016/j.eimc.2020.02.006
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Uso de las tecnologías de secuenciación masiva para el diagnóstico y epidemiología de enfermedades infecciosas
Use of next generation sequencing technologies for the diagnosis and epidemiology of infectious diseases
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Iñaki Comasa,b,
Autor para correspondencia
icomas@ibv.csic.es

Autor para correspondencia.
, Irving Cancino-Muñoza, Carla Mariner-Llicera, Galo A. Goiga, Paula Ruiz-Huesoc, Carlos Francés-Cuestac, Neris García-Gonzálezc, Fernando González-Candelasb,c
a Instituto de Biomedicina de Valencia, IBV-CSIC, Valencia, España
b CIBER en Epidemiología y Salud Pública, Valencia, España
c Unidad Mixta “Infección y Salud Pública” FISABIO-Universitat de València, Instituto de Biología Integrativa de Sistemas, I2SysBio (CSIC-UV), Valencia, España
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Resumen

Por primera vez, la tecnología de secuenciación masiva permite acceder a la información genómica a un precio y a una escala tales, que se está implementado en la práctica clínica y epidemiológica rutinaria. Los obstáculos para dicha implementación son todavía muchos. Sin embargo, ya existen muchos ejemplos de las grandes ventajas que supone en comparación con métodos anteriores. Esto es, sobre todo, porque con una sola determinación podemos obtener simultáneamente información epidemiológica del microorganismo causante, así como de su perfil de resistencias, si bien estas ventajas están más o menos desarrolladas según el patógeno considerado. En esta revisión se repasan varios ejemplos del uso clínico y epidemiológico de la secuenciación masiva aplicada a genomas completos y microbiomas, y se reflexiona sobre su futuro en la práctica clínica.

Palabras clave:
Secuenciación masiva
Genoma
Epidemiología
Vigilancia
Diagnóstico
Resistencias
Abstract

For the first time, next generation sequencing technologies provide access to genomic information at a price and scale that allow their implementation in routine clinical practice and epidemiology. While there are still many obstacles to their implementation, there are also multiple examples of their major advantages compared with previous methods. Their main advantage is that a single determination allows epidemiological information on the causative microorganism to be obtained simultaneously, as well as its resistance profile, although these advantages vary according to the pathogen under study. This review discusses several examples of the clinical and epidemiological use of next generation sequencing applied to complete genomes and microbiomes and reflects on its future in clinical practice.

Keywords:
Next generation sequencing
Genome
Epidemiology
Vigilance
Diagnosis
Resistance
Texto completo
1Secuenciación masiva: promesas y retos en enfermedades infecciosas

Durante décadas, los métodos moleculares han jugado un papel cada vez mayor en el diagnóstico, análisis epidemiológico y vigilancia de las enfermedades infecciosas. Muchas técnicas que inicialmente se desarrollaron en el campo de la investigación básica se han trasladado al campo clínico. Un caso paradigmático es el de la PCR cuantitativa (qPCR). Cuando se desarrolló a finales de 1980, pocos se atrevían a aventurar su papel como elemento diagnóstico, puesto que faltaba estandarización, facilidad de uso y estudios sobre cómo podía funcionar en el entorno clínico. Sin embargo, en 1989 se propusieron las primeras aplicaciones clínicas1,2 y en 2019 ya forman parte del algoritmo diagnóstico de la mayoría de enfermedades causadas por microorganismos. La secuenciación masiva está exactamente donde la qPCR cuando empezó su aplicación clínica. En un entorno controlado, ha demostrado que para varias enfermedades tiene una sensibilidad y especificidad similares a las técnicas convencionales. Poco a poco se está desplegando para su uso rutinario en hospitales de todo el mundo, aunque a distintas velocidades. Países como Reino Unido lideran su implementación, no solo como complemento sino como reemplazo de procedimientos convencionales. Sin embargo, ni siquiera los grandes centros de referencia de muchos países desarrollados la han implementado. En los países en desarrollo, parece todavía una opción lejana, aunque aplicaciones más específicas, para resolver cuestiones complejas o urgentes3, han demostrado que estas técnicas se podrían implementar también allí.

Una situación similar se vive en el campo de la epidemiología y la vigilancia epidemiológica. Las técnicas moleculares, en este caso, se abrieron paso antes que en el campo clínico, pues rápidamente se vio el beneficio de unas técnicas que proveían mayor discriminación que las anteriores4. Del mismo modo, la secuenciación masiva del genoma completo (SGC) ha demostrado un poder de discriminación aún mayor. Sin embargo, al igual que en el entorno clínico, existen todavía obstáculos para su implementación5,6. El análisis bioinformático y filogenético posterior es más complejo y, generalmente, requiere trabajar sobre un cultivo, pues sobre muestra directa la aproximación experimental se vuelve más compleja y costosa. Sin embargo, la secuenciación masiva a partir de cultivo cada vez es más barata. En un sistema Illumina-MiSeq, que permite hasta 24 genomas de 4 Mb (similar al de Mycobacterium tuberculosis o Legionella pneumophila), el coste de reactivos y la secuenciación es de unos 100 euros por muestra. Esto la convierte en una técnica muy atractiva, dado que al obtener la secuencia del genoma, se puede diagnosticar la especie de interés, la presencia de factores de resistencia o virulencia y hacer epidemiología de alta resolución. Muchas de estas aplicaciones están más avanzadas para unos microorganismos que para otros. Por ejemplo, en el caso de la tuberculosis (TB), el campo está suficientemente avanzado como para hacer un uso total de la información, y ha reemplazado al cultivo en algunos países7. Todavía se tiene que desarrollar su implementación para otras especies bacterianas causantes de enfermedades más raras, o en las que no se conocen los determinantes genéticos de la resistencia, o donde es un consorcio y no una única bacteria patógena la que interviene8. En esta revisión, se presentan ejemplos de su uso clínico y epidemiológico para un amplio número de patógenos bacterianos y virales, así como se reflexiona sobre las direcciones que el campo pueda tomar en el futuro.

2Secuenciación masiva en la práctica clínica2.1Aplicaciones en resistencia a antibióticos en el entorno hospitalario

Las bacterias resistentes a los antibióticos representan uno de los grandes desafíos para la salud pública en todo el mundo9. A día de hoy, se conocen bacterias resistentes a todos los antibióticos disponibles. Se ha estimado que el número de muertes anuales causadas por la resistencia a antibióticos en Europa asciende a 23.000 personas y en el mundo a 700.000. Pero esta cifra aumenta continuamente; se ha estimado que en el año 2050, las infecciones por patógenos resistentes serán la primera causa de muerte, por encima del cáncer o las enfermedades del corazón, y causarán más de 10 millones de muertes anuales en todo el mundo10. Las resistencias a los antibióticos están codificadas por mutaciones puntuales en el cromosoma, en plásmidos y/u otros elementos genéticos móviles, incluyendo genes completos integrados en cualquiera de los anteriores. Sin embargo, no todas las bacterias adquieren o presentan las resistencias de igual manera. Existen grandes diferencias en cuanto a sus repercusiones clínicas, tanto individuales como a nivel general. Todo ello, ha llevado a diversas instituciones (ECDC, OMS, CDC) a elaborar listas de patógenos y resistencias para las que se precisa una vigilancia intensa e inmediata11,12.

Las ventajas que presenta la SGC sobre otras alternativas la hacen inmejorable para la vigilancia. Pero la pregunta es: ¿cabe adoptar la secuenciación genómica como técnica rutinaria para evaluar la sensibilidad a antibióticos de bacterias patógenas? Por ejemplo, en un estudio de nuestro grupo con 111 aislados de Klebsiella pneumoniae productora de BLEE (betalactamasas de espectro extendido), se observó una coincidencia del 95,3% (1.469/1.542) de las pruebas en que se comparó la presencia de factores de resistencia en las lecturas de secuenciación masiva y los fenotipos de sensibilidad obtenidos con Vitek. Además, la mayoría de discrepancias correspondía a betalactámicos (6,1%, 62/1.018) y se concentraban en unos pocos aislados, lo que puede indicar la presencia de factores aún no bien caracterizados como responsables de resistencias a varios antibióticos.

Uno de los mayores obstáculos para su implementación en la práctica clínica es la necesidad de análisis bioinformáticos rigurosos y rápidos. Se están dando pasos en ese sentido. Por ejemplo, SRST213 o ARIBA14 son programas que permiten la caracterización detallada de los aislados y las resistencias que presentan sin un análisis bioinformático muy pormenorizado. Esto quiere decir que pocos minutos después de acabar un experimento de secuenciación se puede tener información de la especie, el patrón de tipado (MLST) y la presencia de mutaciones o genes de resistencia conocidos. De hecho, es la doble utilidad de la información genómica, en clínica y en epidemiología, la que abre la posibilidad de una implantación paulatina de esta tecnología en los laboratorios de microbiología clínica. Mientras se producen los avances necesarios para emplear la secuenciación masiva como tecnología de rutina, la formación del personal, la adquisición de equipos y la familiarización con los procedimientos de preparación y análisis posterior pueden realizarse con objetivos de vigilancia. Esta es la estrategia seguida por la Red Valenciana de Vigilancia de Resistencias a Antimicrobianos que, partiendo de las recomendaciones del PRAN, está implementando en hospitales la secuenciación masiva de aislados de vigilancia especial (p. ej., aislados de K. pneumoniae productores de carbapenemasas), de forma que en ellos se puedan realizar todas las tareas necesarias tras la oportuna formación y actualización de conocimientos. El análisis de los resultados se realizará en 2 niveles, tanto en cada hospital como de forma integral para toda la comunidad autónoma, en conexión con la Dirección General de Salud Pública, como responsable directa del PRAN en la Comunitat Valenciana. El modelo, una vez implantado, puede extenderse a los demás microorganismos cuya vigilancia se considere necesario realizar mediante secuenciación masiva, facilitando así la futura adopción como tecnología de rutina en los hospitales, ya con aplicaciones directamente en la práctica clínica.

2.2Identificación de resistencias a antibióticos en tuberculosis

Desde la década de 1990, la transmisión de cepas del M. tuberculosis complex (MTBC) resistentes a antibióticos se ha hecho más evidente cada año, convirtiéndose en un problema económico y de salud pública a nivel mundial15. Se estima que se producen alrededor de medio millón de casos nuevos por año, por lo que resulta un grave problema en los esfuerzos para erradicar la enfermedad, ya que supone un reto para el diagnóstico y para el tratamiento16. Dado que M. tuberculosis es una especie clonal en la que no se produce recombinación ni transferencia horizontal de genes, el mecanismo de adquisición de resistencias suelen ser las mutaciones puntuales17. En cuanto a la sensibilidad y especificidad de la SGC frente a los ensayos de sensibilidad a antibióticos, varios estudios han demostrado que, para los dos antibióticos de primera línea más importantes (rifampicina e isoniacida), la detección de resistencias es tan buena o incluso mejor que el cultivo, obteniéndose una sensibilidad de 0,98 y especificidad de 0,98 para rifampicina, y unos valores de 0.97 y 0.93 para isoniacida, respectivamente18. Para el resto de antibióticos de primera línea y los de segunda línea, la sensibilidad y especificidad son más variables entre los distintos estudios. Desde 2017, centros de salud pública de Reino Unido, Países Bajos y Nueva York están empezando a reemplazar los tests fenotípicos por SGC, tanto para identificar MTBC como para obtener el perfil de resistencias7.

Sin embargo, una de las limitaciones de la técnica es la falta de estandarización en la parte del análisis bioinformático19, así como de catálogos completos de mutaciones. En otras palabras, se conocen las mutaciones más comunes, pero las más raras representan un desafío. Nuestro grupo ha publicado el caso de un paciente de TB que no respondía al tratamiento durante más de 2 años, a pesar de que todas las pruebas rutinarias (cultivo y moleculares) en el hospital no detectaron resistencias. Demostramos que el paciente en realidad era multi y extremadamente resistente (MDR-TB y XDR-TB) debido a una serie de mutaciones raras a rifampicina e isoniazida, que hacían que la bacteria creciera excesivamente lenta en el medio de cultivo20. El mismo estudio usa la información genómica para informar de la aparición de nuevas resistencias durante el tratamiento. A medida que se han ido realizando estudios como el comentado, y se han encontrado mutaciones en genes de MTBC asociadas a resistencia a antibióticos21, ha ido aumentando la necesidad de generar bases de datos que recopilen dichas mutaciones. Por un lado, están CASTB, TBProfiler y PhyReSE, que son bases de datos públicas con las mutaciones más frecuentes conocidas y permiten analizar las secuencias de forma automática22–24. Por otro lado, para avanzar en la identificación de nuevas mutaciones diagnósticas existen principalmente 2 consorcios, CRyPTIC (www.crypticproject.org) y ReSeqTB (https://platform.reseqtb.org). En un futuro, la mejora de los catálogos y la optimización y el uso correcto de SGC podría llegar a hacer posible la obtención de un diagnóstico completo y preciso para dar un tratamiento personalizado a cada paciente de MDR y XDR-TB25.

2.3Aplicaciones en virología clínica

Una de las áreas en que la secuenciación masiva ha mostrado claras ventajas sobre técnicas convencionales es la identificación de los agentes infecciosos virales presentes en una muestra, incluyendo nuevos virus, pues no se necesita información previa sobre el genoma de una especie para su detección. El análisis de la microbiota tiene dificultades técnicas importantes para su uso rutinario, especialmente si estamos interesados en su fracción viral26; a las dificultades en la identificación inequívoca de los virus presentes en una muestra compleja, se puede añadir el problema de diferenciar entre colonización e infección, o la creciente información sobre contaminantes virales en los materiales y reactivos usados en estas técnicas27. Con todo, hay ejemplos concretos en los que la secuenciación masiva ha permitido la detección del virus de la parotiditis en líquido cerebroespinal28 o el de la rubéola en un paciente con oftalmitis29, cuando las técnicas habituales no habían logrado establecer el patógeno causante de las infecciones.

Son numerosos los casos en que la secuenciación masiva ha demostrado una capacidad muy superior a la secuenciación Sanger para detectar e identificar mutaciones de resistencia a antivirales, a pesar de encontrarse estas en una baja frecuencia30. Aunque la aplicación mayoritaria de esta técnica se realiza con virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)31–33, también se emplea con otros virus, como el virus de la hepatitis C (VHC)34,35, citomegalovirus36, virus de la hepatitis B37, virus de la hepatitis A38 o virus de la gripe39. Las recomendaciones actuales de evaluación de mutaciones de resistencia en VIH40 no incluyen la determinación rutinaria de mutaciones minoritarias, que aún se encuadran en el marco de la investigación, si bien podrían considerarse para NNRTI (inhibidores no-análogos de nucleósidos de la transcriptasa inversa). La evidencia sobre su asociación con fallo terapéutico no parece ser lo bastante concluyente como para considerarse una prueba a realizar de forma rutinaria41–44. Sin embargo, su capacidad para transmitirse en un inóculo infectivo parece fuera de duda33,45,46.

Un caso particular, pero de gran relevancia clínica y epidemiológica, lo ofrecen los virus de ARN que producen infecciones crónicas, como VIH y VHC. En ellos se unen unas elevadas tasas de mutación con tiempos prolongados de infección, lo que permite observar la evolución de la población viral a lo largo del tiempo. La compartimentalización47–50, unida a la mutación y diferente accesibilidad de los fármacos a distintos tejidos y órganos, puede contribuir al fallo terapéutico. En este caso, la posibilidad de analizar con detalle la población de virus presentes en un paciente a lo largo del tiempo, es un importante activo de la secuenciación masiva51. El análisis de esta diversidad intraindividual también puede revelar la existencia de coinfección o sobreinfección, frecuentemente asociada a grupos con elevadas tasas de prácticas de riesgo52. Esta misma aproximación se utiliza para analizar la transmisión del virus entre pacientes, si bien su sentido es difícil de inferir solo a partir del análisis de las secuencias y sin información clínica o epidemiológica adicional53.

Por último, la información derivada de la secuenciación masiva podría emplearse para analizar con detalle las cadenas de transmisión y brotes virales, tanto en un contexto epidemiológico como forense. Respecto al primero, la utilidad se ha demostrado en numerosos ejemplos, quizá los más llamativos son los análisis “sobre el terreno” de los brotes de virus Ebola54, Zika55,56 o chikungunya57 utilizando secuenciación de tercera generación. Sin embargo, la determinación inequívoca de la transmisión viral entre individuos concretos, así como su dirección, en su caso, exclusivamente a partir de la información obtenida mediante secuenciación masiva debe tomarse aún con precaución, y hay observaciones discrepantes al respecto58–60, a las que hay que añadir relevantes cuestiones metodológicas61,62.

2.4Aplicación en metagenómica clínica y microbioma

La metagenómica consiste en la secuenciación masiva de todas las moléculas de ADN presentes en una muestra que, a su vez, provendrán de los organismos que están, o estuvieron, presentes en ella. La capacidad de detectar en un solo ensayo todos los patógenos potenciales de una muestra (incluyendo los viables no cultivables) supone una clara ventaja respecto a los métodos de diagnóstico tradicionales, que requieren de la acotación previa del patógeno que se pretende identificar. En la práctica clínica, la metagenómica se usó de manera efectiva por primera vez para el diagnóstico y tratamiento de un paciente de neuroleptospirosis en estado crítico63. El paciente había dado negativo en diversas baterías de tests microbiológicos, incluyendo ensayos clínicos para leptospirosis. Tras la identificación de tan solo un 0,016% de Leptospira mediante secuenciación masiva, el paciente fue puesto en tratamiento y mejoró rápidamente. En un reciente estudio con más de 200 pacientes de meningitis y encefalitis, en el que se comparó la metagenómica con tests diagnósticos convencionales, un 22% de los casos infecciosos se identificó únicamente mediante secuenciación masiva. Sin embargo, en un 45% de los casos solo los tests convencionales fueron capaces de detectar el agente infeccioso. Esto pone de manifiesto que, mientras la metagenómica es capaz de llegar a unos niveles de sensibilidad sin precedentes, es una técnica todavía inmadura y que requiere de mejoras antes de poder implementarse en su uso clínico rutinario. Sin embargo, el verdadero potencial de la metagenómica va mucho más allá de la mera detección de patógenos.

Acceder al genoma de los patógenos permite identificar la cepa (o cepas) involucradas en la infección y detectar mutaciones y genes de resistencia además de otros factores de virulencia. Asimismo, la metagenómica se ha usado en el estudio de brotes bacterianos como el de la fiebre de Lassa de 2018 en Nigeria, brotes nosocomiales de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos o brotes de origen alimentario, y es capaz de identificar el origen y los eventos de transmisión entre pacientes64–66. Pero, probablemente, la aplicación más conocida sea la caracterización de los microbiomas, es decir, de las comunidades bacterianas que habitan en los distintos órganos y tejidos humanos y que pueden estar asociadas a enfermedades tanto agudas como crónicas67. Se ha demostrado que las alteraciones del microbioma normal, conocidas como disbiosis, están relacionadas con enfermedades como la diabetes, la enfermedad de Crohn o la enfermedad de Alzheimer68,69. Esto sitúa a la metagenómica como una herramienta ideal para el tratamiento y seguimiento de estas enfermedades. Un ejemplo claro son las infecciones causadas por el patógeno oportunista Clostridiumdifficile, para las cuales la metagenómica ha demostrado que el trasplante fecal es un tratamiento con una alta tasa de éxito70.

Sin embargo, la implementación de la metagenómica continúa siendo demasiado difícil y costosa para su uso rutinario en la práctica clínica. La mayor parte de la metagenómica se lleva a cabo en laboratorios de investigación, con herramientas que están en constante desarrollo y cambian cada poco tiempo, especialmente en la parte del análisis computacional. Este ambiente de constante cambio supone una barrera para su implementación en un sistema de salud pública que necesita de procedimientos estandarizados que se puedan validar para un uso clínico por los organismos competentes. No obstante, en comparación a los métodos tradicionales, la metagenómica provee una cantidad de información microbiológica sin parangón y es de esperar que, conforme se solventen sus limitaciones técnicas, y dada su utilidad clínica, sustituya a muchas de las técnicas microbiológicas actuales en un futuro próximo71.

3Secuenciación masiva en epidemiología y vigilancia3.1Aplicación a brotes hospitalarios

La utilización de genomas completos en el contexto de análisis de brotes epidemiológicos es una metodología de aplicación muy reciente72,73. En nuestro grupo, el trabajo realizado por Ruiz-Hueso et al74 analiza genomas completos de aislados de Pseudomonas aeruginosa en 3 contextos de transmisión nosocomial de características muy diferentes, lo que refleja el grado de utilidad de esta tecnología en todo tipo de circunstancias. El caso más sencillo fue un posible brote localizado en el área de hematología del hospital A. Ante la elevada tasa de mortalidad entre los posibles afectados y su posible asociación con la patología de base que padecían, se requirió su confirmación. Solo se disponía de 12 muestras de 6 pacientes de un brote que podría estimarse en alrededor de 20 afectados. Se procedió a la secuenciación de sus genomas y el análisis filogenético confirmó que se trataba del mismo tipo de aislado en todos los casos, con unas diferencias mínimas entre los genomas completos de los 12 aislados. Los resultados por MLST indicaron que se trataba del ST175, un secuenciotipo de amplia distribución a nivel mundial75, por lo que, aunque la sospecha fue grande, no se pudo asumir un mismo origen sobre la base de tan solo esta información. La utilización de varias muestras por paciente en este contexto es útil también para tratar de determinar si pudieran existir infecciones por varios clones diferentes. En nuestro estudio, los resultados respaldaron la idea de un único clon, ya que el número de diferencias nucleotídicas entre los genomas de las muestras de P. aeruginosa a nivel intrapaciente era 0 o 1.

En situaciones más complejas, el análisis filogenómico (estudio filogenético de la totalidad del genoma) permite no solo confirmar la presencia de un brote y discriminar a los pacientes que forman parte de este sino también establecer su grado de extensión, así como posibles fuentes de infección. El siguiente caso trató de un brote extenso, en el que podían estar involucrados 64 pacientes. Inicialmente se planteó como un brote localizado en el servicio de nefrología del hospital B, pero se fueron incorporando muestras de pacientes localizados en otras zonas a medida que el número de infecciones por P. aeruginosa fue aumentando en dicho hospital. Gracias al uso de la misma metodología se confirmó el brote y la dispersión del patógeno a otras áreas, pero la estructura evolutiva de los aislados era mucho más compleja de la esperada para un solo brote. De hecho, reveló la presencia de pequeños brotes, en contraposición a un único brote detectado por marcadores convencionales.

El tercer caso tratado por Ruiz-Hueso et al. tenía como objetivo estudiar la evolución de la bacteria en pacientes de un mismo hospital (hospital C) que hubieran tenido infecciones prolongadas y/o en distintas partes de su organismo. Lo único que estos pacientes tenían en común eran infecciones repetidas y de larga duración, además de no padecer fibrosis quística. Las muestras de 16 pacientes, 92 en total, tomadas a lo largo de 3 años, dieron lugar en un árbol filogenético a la estructura particular de un brote infeccioso que contenía más del 80% de estas. La estructura era muy similar al caso anterior, y en ella se observan distintas agrupaciones debidas a diferencias genéticas suficientemente grandes para poder hablar de varios brotes, o cadenas de transmisión, simultáneos de P. aeruginosa del mismo secuenciotipo. Gracias a este resultado, y al cruce con datos de las estancias de los pacientes involucrados, se pudo localizar un posible foco inicial.

3.2Aplicación a brotes comunitarios: tuberculosis

El uso del genoma completo como marcador epidemiológico está revolucionando la epidemiología molecular de la TB76. Se ha comprobado que la SGC ayuda resolver brotes de transmisión que aparentan idénticos con las técnicas de tipado convencionales. Por ejemplo, Wyllie et al77 demostraron que la técnica MIRU-VNTR sobrestima la transmisión reciente en Reino Unido, especialmente, en individuos extranjeros. La SGC también ha demostrado una mayor congruencia con las investigaciones epidemiológicas78 o para detectar brotes de transmisión que circulan entre diferentes países79.

Nuestro grupo de investigación ha estado trabajando en diferentes aplicaciones de la SGC de TB en la Comunidad Valenciana. Como parte de un proyecto que incorporar a la Dirección General de Salud Pública, así como a la mayor parte de hospitales públicos de la Comunidad Valenciana, hemos secuenciando la gran mayoría de casos de cultivo positivos desde 2014. Los datos preliminares que se presentan se refieren al período 2014-2016. En total se aplicó SGC en 785 aislados clínicos que provenían de 18 hospitales diferentes. Utilizando los datos obtenidos por SGC, se identificó que el 35% de los aislados estaban relacionados a transmisión reciente. Este porcentaje es mucho mayor que en otras áreas del espacio europeo y sugiere que la transmisión todavía juega un papel importante en el número de casos todos los años. Por otra parte, las técnicas epidemiológicas convencionales (estudio de contactos) solo identificaron algún tipo de transmisión en el 10% de todos los aislados. Utilizando los brotes de transmisión obtenidos por SGC, y con ayuda de investigaciones epidemiológicas, en algunos casos se logró confirmar la transmisión detectada por el estudio de contactos mientras que en otros, se realizaron investigaciones de campo para detectar el vínculo epidemiológico entre los diferentes individuos de un grupo de transmisión.

Se presentan 3 ejemplos:

  • El primero es la “confirmación retrospectiva de un brote conocido”. Ocurrió en una residencia de ancianos donde hubo 4 casos de TB; aquí, la concordancia entre epidemiología convencional y genómica fue evidente.

  • El segundo es la “exclusión durante un brote prospectivo”. Ocurrió en un colegio privado donde en 2 meses se diagnosticaron 4 contagios en un aula infantil (todos con 3 años). Tres meses después se diagnosticó un nuevo caso de TB, un alumno de 17 años perteneciente a un aula para mayores, el cual no tenía vinculación directa con los niños pequeños. El análisis genómico desvinculó este último caso del brote en el aula de infantil y se asoció con otro brote de 5 casos entre adultos de la ciudad.

  • El tercer ejemplo es lo que se puede llamar “ampliación plausible de un brote y alerta”. Ocurrió entre población extranjera sin techo, que vive en los asentamientos periurbanos y albergues sociales de la ciudad. El estudio de contactos identificó 2 casos con vínculo epidemiológico bien establecido. Gracias a la SGC, se detectaron 2 casos adicionales, que presentaban un perfil sociodemográfico muy similar. Cabe mencionar que estos 4 casos alcanzaron la cifra de 7 ingresos por TB, contando episodios iniciales y recaídas.

3.3Aplicación de la secuenciación genómica a la microbiología forense

El establecimiento de la microbiología forense como disciplina80 se produjo a raíz de los ataques bioterroristas con carbunco ocurridos en 2001 en Estados Unidos, también conocidos como amerithrax. En este caso, se aplicó la SGC81,82, aunque no mediante las tecnologías de secuenciación masiva actuales. De hecho, ya sea por razones legales o, simplemente, por no haberse aplicado todavía esta tecnología en este tipo de estudios, hasta muy recientemente no se había publicado ningún trabajo que emplease la secuenciación masiva en una transmisión bacteriana dentro del campo de la microbiología forense.

El primer estudio publicado en este contexto implica un posible caso de abuso sexual a una menor con transmisión de la bacteria Neisseria gonorrhoeae sucedido en España en 201783. Se decidió usar la SGC de las cepas aisladas del presunto agresor, la víctima y 3 controles locales, porque las técnicas moleculares habituales, como el MLST4 y la electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE), no proporcionaron suficiente resolución. De hecho, en este estudio el MLST no pudo discriminar entre las cepas del caso y los controles, ya que todos poseían el mismo ST9363, mientras que la PFGE, a pesar de tender a ser más discriminativa que el MLST4,84, no pudo diferenciar entre las cepas del caso y uno de los controles.

El trabajo de Francés-Cuesta et al83 combina estrategias de mapeo de las secuencias frente a un genoma de referencia lo más próximo genéticamente posible. Con esta metodología se pudo comprobar que las cepas aisladas del sospechoso y la víctima eran completamente idénticas, mientras que el control que no pudo ser diferenciado de las cepas del caso mediante PFGE difería en 2 nucleótidos. Dado que este paciente control no tenía relación conocida con los individuos implicados en el caso, los autores sugieren la posibilidad de una fuente de infección común para el control y el sospechoso, con el fin de explicar la casi perfecta identidad entre los genomas gonocócicos de este control y los del caso. Respecto a la dirección de la transmisión, aunque la obtención de la secuencia genómica no permite determinarla, dadas las características del propio caso, esta es bastante obvia. Este primer ejemplo de aplicación de la secuenciación masiva a la microbiología forense abre las puertas al establecimiento de unas bases metodológicas aplicables al análisis de transmisiones bacterianas en un contexto pericial forense.

4Conclusiones. El futuro de la tecnología y su papel en la práctica clínica y epidemiológica

La secuenciación masiva ha alcanzado un alto grado de madurez para la investigación, pero aún se halla a diferentes niveles de uso en la práctica clínica y epidemiológica. A nivel epidemiológico, ya es la herramienta recomendada para genotipado por la ECDC y otras agencias, si bien su utilización dista de ser sistemática excepto en algunos países (p. ej., Reino Unido) o aplicaciones (brotes de patógenos asociados a alimentos) (https://ecdc.europa.eu/en/publications-data/monitoring-use-whole-genome-sequencing-infectious-disease-surveillance-europe). A nivel de la microbiología clínica, si bien su penetración es desigual según enfermedades, cada vez tiene un rol más predominante6. A esto se une la llegada de los secuenciadores de tercera generación. Por ejemplo, los secuenciadores de nanoporos (MinION, GridION, etc., de Oxford Nanopore Technologies) que permiten la generación de la información genómica desde una única molécula, sin requerir pasos previos de amplificación por PCR y, además, la lectura en tiempo real, lo que lleva a una mayor rapidez en el diagnóstico. Sin embargo, estos secuenciadores todavía llevan asociados mayores niveles de error en la lectura, aunque mejoran con cada actualización. Secuenciadores con tecnologías similares o totalmente nuevas están cerca de ser lanzados al mercado. Sin embargo, tanto unas tecnologías como las otras requieren mejorar los resultados sobre muestras complejas en comparación con los avances hechos sobre cultivos puros71.

A la vista de los ejemplos expuestos, está claro que la secuenciación de genomas completos es el presente para muchas aplicaciones como la vigilancia y la epidemiología. Su instauración como método rutinario en microbiología clínica dependerá mucho de la resolución de obstáculos para su implementación rutinaria6, las enfermedades a tratar y, sobre todo, del beneficio y rendimiento obtenidos85. Hay microorganismos que se pueden diagnosticar rápidamente con métodos fenotípicos o con los métodos moleculares disponibles y no necesitan de información adicional. Sin embargo, para los agentes causantes de muchas enfermedades, incluidos todos los microorganismos “fastidiosos”, escenarios como la detección de resistencias mediadas por plásmidos y la posibilidad de la caracterización completa es un salto adelante significativo. Dicho salto probablemente se de en los países desarrollados en los próximos 5 años, posiblemente acompañado de soluciones globales para la preparación de las muestras y el análisis de los resultados86. Los hospitales, por lo menos los de referencia, probablemente potenciarán la presencia de soporte bioinformático e incluso los más pequeños tendrán acceso a aplicaciones web para los análisis más rutinarios y estandarizados87. Muchos de estos avances ya están disponibles localmente en algunos países del mundo desarrollado. En el mundo en vías de desarrollo, donde estas técnicas tienen un gran potencial para enfermedades endémicas de alta incidencia, el conjunto de problemas es similar pero a diferente escala, incluyendo limitaciones en el acceso a internet, el mantenimiento de la cadena de frío o el apoyo bioinformático19.

5Financiación

El trabajo en el laboratorio del Dr. Iñaki Comas está financiado por MICIU (SAF2016-77346-R), Generalitat Valenciana (AICO/2018/113) y el European Research Council StG 638553. El trabajo en el laboratorio del Dr. Fernando González-Candelas está financiado por MICIU (proyecto BFU2017-89594R), Generalitat Valenciana (PROMETEO206-122) y Conselleria de Sanitat Universal i Salut Pública.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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