El cultivo de muestras de agua es el método de referencia para detectar Legionella spp. en instalaciones sanitarias. Hasta 2017, la UNE-EN ISO 11731 solo incluía el medio GVPC, capaz de inhibir microbiota interferente, aunque dificulta el crecimiento de Legionella spp. Para mejorar su recuperación la nueva norma incorpora el medio BCYE al protocolo de trabajo.
MétodosInoculamos en BCYE y GVPC 1.306 muestras de agua sanitaria según procedimiento interno acreditado. Comparamos el número de ufc/L de Legionella spp. detectados en ambos medios.
ResultadosLa mediana en BCYE fue 2.000ufc/L mayor que en GVPC (p=0,000). En presencia de elevada cantidad de microbiota interferente, ambos medios fueron similares. Con escasa microbiota interferente BCYE fue 4 veces más sensible que GVPC (p=0,000).
ConclusiónIncluir BCYE en el análisis de agua sanitaria mejora significativamente la recuperación de Legionella spp. en muestras poco contaminadas.
Water sample culturing is the reference method to detect Legionella spp. in sanitary facilities. Until 2017, UNE-EN ISO 11731 only included the GVPC medium, which inhibits interfering microbiota but hinders the growth of Legionella spp. To improve its recovery, the new standard incorporates the BCYE medium into the working protocol.
MethodsWe inoculated 1,306 sanitary water samples onto BCYE and GVPC according to an accredited internal procedure. We compared the number of cfu/L of Legionella spp. detected in both media.
ResultsThe median in BCYE was 2,000cfu/L higher than in GVPC (p=0.000). In the presence of high amounts of interfering microbiota, both media were similar; in the absence or low interfering microbiota BCYE was four times more sensitive than GVPC (p=0.000).
ConclusionIncluding BCYE in the analysis of sanitary water significantly improves the recovery of Legionella spp. in low contaminated samples.
La legionelosis está causada principalmente por Legionella pneumophila serogrupo 1, aunque otras especies como Legionella anisa también pueden causar la enfermedad1,2. Legionella spp. coloniza los sistemas de abastecimiento de agua y sobrevive como parásito intracelular de amebas y asociada a biofilms2,3. El control microbiológico de la red de agua sanitaria es crucial para reducir el riesgo de infección4,5. El cultivo es el método de referencia, y hasta 2017, GVPC era el medio recomendado por la normativa vigente6. El Real Decreto 487/2022 establece requisitos sanitarios para la prevención de la legionelosis, incluyendo la acreditación de laboratorios de análisis de Legionella spp., la toma de muestras y su cultivo7. La UNE-EN ISO 11731:2017 establece diferentes procedimientos y medios de cultivo selectivos (GVPC, MWY y BCYE con cefazolina, polimixina B y piramicina (BCYE+AB)) y no selectivos (BCYE)8. La elección de los métodos de cultivo influye en los resultados del análisis y podría determinar el rango de concentraciones que condicionan las medidas de control de instalaciones9–11.
Material y métodosRealizamos un estudio comparativo de métodos de cultivo para detección y recuento de Legionella spp. en muestras de agua sanitaria, evaluando los resultados obtenidos en términos de sensibilidad y del medio utilizado con mayor frecuencia para informar los recuentos máximos de colonias. Durante 5 años cultivamos 1.304 muestras siguiendo un procedimiento interno acreditado (UNE-EN ISO 11731:2007) que incluía la siembra tras filtración y elución, sin pretratamiento (ST), con pretratamiento ácido (FA) y con calor (FC) en medios BCYE y GVPC (Becton Dickinson®). La detección se realizó con un límite de 100ufc/L y las colonias confirmadas como Legionella spp. por inhibición en BCYE-cys fueron serotipadas mediante aglutinación con látex (Legionella látex test OXOID®). Realizamos controles de calidad de los medios de cultivo para confirmar las condiciones de esterilidad, productividad y selectividad, según la norma ISO 11133, utilizando cepas de referencia (Legionella pneumophila CECT 7109, Enterococcus faecalis ATCC® 29212, Escherichia coli ATCC® 25922, y Legionella anisa CECT 8177T), resultando siempre dentro del rango declarado. Utilizamos el análisis bivariante para comprobar las correlaciones entre parámetros, las pruebas de normalidad Kolmogorov-Smirnov, la prueba de Mann-Whitney para dos muestras independientes, la prueba X2 de Pearson y la prueba exacta de Fisher para analizar los resultados obtenidos y establecer correlaciones entre los parámetros evaluados (medio de cultivo, método de pretratamiento, presencia de otros microorganismos, cloro libre, pH y temperatura).
ResultadosEl 69% (896) de las muestras fueron positivas. La especie mayoritaria fue L. pneumophila serogrupo 2-14 (83,8%).
El recuento medio fue de 47.185ufc/L, con una mediana de 6.750ufc/L. La sensibilidad aumentó utilizando el medio BCYE, informando mayores recuentos de colonias en 563 ocasiones con BCYE (63%) vs. 333 con GVPC (37%). BCYE es 1,7 veces más sensible que GVPC. Existen diferencias significativas en el número de colonias informadas según el medio utilizado, siendo la mediana en BCYE 2.000 unidades mayor que en GVPC (p=0,000) (fig. 1 y tabla 1).
Comparación de la mediana del número de ufc/L informado en BCYE y GVPC
| Análisis comparativo recuento máximo promedio | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Total | Recuento máximo medio en BCYE | Recuento máximo medio en GVPC | Prueba de Mann-Whitney | ||
| ufc/L informado | N válido | 896 | 563 | 333 | p=0,000 |
| Media | 47.185,38 | 60.391,58 | 24.857,80 | ||
| Desviación estándar | 243.474,54 | 300.026,21 | 81.448,35 | ||
| Mediana | 6.750,00 | 7.700,00 | 5.700,00 | ||
En presencia de elevada cantidad de microbiota interferente, ambos medios son similares; en ausencia o con escasa microbiota interferente, BCYE es 4 veces más sensible que GVPC (p=0,000). No hay diferencias significativas en las distribuciones del número de colonias informadas según la microbiota acompañante (p>0,05). La ausencia de preparamiento (FST) induce el mayor número de recuentos máximos de colonias en ambos medios (BCYE y GVPC) (p<0,000), entre 40-44% respectivamente. No hay diferencias significativas según las características físico-químicas de las muestras (pH, cloro, temperatura).
DiscusiónEn nuestro estudio, observamos una mejora significativa en la recuperación de Legionella spp. al incluir BCYE en el análisis del agua. Varios autores han comparado la eficacia de los medios enriquecidos y selectivos para aislar Legionella spp. de muestras de agua. Tradicionalmente, se ha demostrado que los medios selectivos como GVPC, DGVP y MWY son más efectivos en el aislamiento de L. pneumophila, especialmente en muestras contaminadas9–11. Sin embargo, el medio GVPC contiene glicina que puede inhibir el crecimiento de otras especies de Legionella, proponiéndose el medio BCYE como mejora para su recuperación11. Solo Ditommaso et al.12 y Scaturro et al.13 analizaron los recuentos comparativos en medios no selectivos (BCYE) y selectivos (GVPC/MWY).
Ditommaso et al.12 demostraron que el uso de BCYE para el recuento de Legionella spp. en muestras no contaminadas resultó en un mayor número de ufc/L informadas en el 93% de muestras positivas en comparación con el uso de MWY (p<0,001)12. Resultados corroborados por los mismos autores en 2022, encontrando una mayor frecuencia de muestras positivas con BCYE (94,8%) en cultivos que contenían solo Legionella spp. en comparación con MWY (85,1%)14. Scaturro et al.13 encontraron mayor porcentaje de muestras positivas con GVPC y aunque las medianas de ufc/L en BCYE fueron superiores a las detectadas en GVPC (2.500 vs. 1.350) (p<0,0001) no superando un logaritmo, no lo consideraron relevante para la evaluación del riesgo de la instalación13. En nuestros datos, BCYE demostró ser 4 veces superior a GVPC en muestras contaminadas y la mediana en BCYE fue más de 3 logaritmos superior a la obtenida en GVPC (p=0,000). En el estudio indicado, el 63% de las muestras se informaron con el máximo recuento de colonias en BCYE, lo que representa casi el doble de informes en comparación con GVPC, lo que se consideró relevante para el control de la instalación. Los autores sugieren que la discordancia en los resultados podría estar relacionada con diferencias y/o errores metodológicos14.
Nuestros datos muestran que el rendimiento de BCYE en muestras contaminadas no fue significativamente diferente al de GVPC (p>0,05). Asimismo, otros estudios han demostrado que el uso de medios selectivos, como MWY, puede resultar beneficioso para el cultivo de muestras con microbiota interferente, ya que facilita la interpretación de los cultivos en comparación con BCYE12,14.
Nuestros resultados, al igual que los de Ditommaso et al.12, han demostrado la eficacia del uso de BCYE junto a medios selectivos para controlar la contaminación por Legionella spp. en instalaciones sanitarias. La norma UNE-EN ISO 11731:2017 ha validado esta práctica, al incluir el uso combinado de medios selectivos y no selectivos8. En la adaptación del análisis del agua de una red de agua sanitaria según la norma, si se realiza mediante siembra tras filtración y elución, debe emplearse un medio de cultivo no selectivo como BCYE junto con un medio selectivo como GVPC.
Consideraciones éticasEl estudio fue aprobado por el Comité de Ética del HGUV.
FinanciaciónLa presente investigación no ha recibido ayudas específicas provenientes de agencias del sector público, sector comercial o entidades sin ánimo de lucro.
Declaración de acceso a datosTodos los datos relevantes están dentro del documento y sus archivos de información de apoyo.
Declaración de IA generativa y tecnologías asistidas por IA en el proceso de redacciónDurante la preparación de este trabajo, los autores utilizaron Paperpal para realizar la revisión del formato. Después de utilizar esta herramienta/servicio, los autores revisaron y editaron el contenido según fuese necesario y asumen total responsabilidad por el contenido de la publicación.
Conflicto de interesesLos autores han declarado que no existen intereses contrapuestos.
