Sr. Director: La cuantificación del ARN del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es en la actualidad el mejor parámetro predictivo de la progresión a síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida), así como un marcador de respuesta al tratamiento con antirretrovíricos1,2. Por este motivo, es necesaria su determinación en los laboratorios implicados en el seguimiento de los pacientes infectados por el VIH-1.
La detección de ácidos nucleicos por diferentes técnicas de biología molecular: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) y branched ADN (b-ADN), ha permitido desarrollar diversos ensayos dirigidos a cuantificar la carga vírica del VIH-1. Las diferencias existentes entre ellos afectan principalmente a la sensibilidad, capacidad de detectar subtipos diferentes al subtipo B, volumen de muestra utilizado, número de muestras procesadas en un solo ensayo, duración del mismo y la posibilidad de automatización3,4. La elección de la técnica más adecuada para un determinado laboratorio deberá tener en cuenta, entre otras, las variables anteriormente mencionadas.
El objetivo de nuestro trabajo fue ensayar la aplicación de la técnica NucliSens HIV-1 QT (Organon Teknika, Durham, NC) basada en tecnología NASBA y compararla con la técnica Amplicor HIV-1 Monitor v 1.0 (Roche Diagnostics Systems, Branchburg, NJ) utilizada habitualmente en nuestro laboratorio. Una de las principales diferencias entre ambas técnicas se encuentra en el proceso de amplificación. NucliSens amplifica secuencias de ARN mediante una técnica isotérmica llevada a cabo por la actividad combinada de tres enzimas diferentes. Respecto a Amplicor Monitor, la amplificación se efectúa por PCR utilizando una sola enzima. Asimismo, NucliSens incorpora 3 calibradores por muestra, mientras que Amplicor Monitor utiliza sólo un patrón de cuantificación e introduce al menos 2 controles externos (negativo, positivo bajo y/o positivo alto) por ensayo. Por tanto, la realización de Amplicor Monitor requiere la utilización de un termociclador, mientras que en NucliSens ésta se efectúa en un baño maría. Es de destacar que dicho baño no es sustituible por un termobloque calefactor como ensayamos nosotros en un principio, obteniendo con ello amplificaciones defectuosas al no ser proporcionales entre los 3 calibradores, no pudiendo calcular la recta de regresión.
El estudio fue realizado en pacientes adultos infectados por el VIH-1, sometidos a tratamiento con terapia antirretrovírica y atendidos en nuestro hospital en el período comprendido entre noviembre de 1998 y enero de 1999.
Las muestras se obtuvieron en tubos con EDTA como anticoagulante efectuando la separación del plasma en las 6 h siguientes a la extracción del mismo. Se separaron 3 alícuotas de cada muestra y se conservaron a 70 °C hasta su utilización.
El volumen de la muestra fue diferente según la técnica utilizada. Amplicor Monitor está diseñada para 200 µ l, obteniéndose una sensibilidad de 400 copias/ml. NucliSens posee la misma sensibilidad con igual volumen de muestra, pero permite modificar el mismo según la sensibilidad que se pretenda alcanzar; 80 copias/ml en 1 ml y 40 copias/ml en 2 ml. En esta ocasión elegimos 1 ml de muestra con objeto de aumentar la sensibilidad.
Se compararon 74 muestras, en 22 de ellas no se detectó ARN vírico por ninguna de las técnicas, 39 se consideraron positivas por ambas y en 13 los resultados fueron discrepantes; siete de ellas detectables únicamente por Amplicor Monitor y seis por NucliSens; en ambas técnicas el intervalo de detección de carga vírica expresada en logaritmo de número de copias/ml fue de 2-2,6 y 2,2-2,8, respectivamente.
En el estudio comparativo de las muestras con ARN vírico cuantificable, el coeficiente de correlación de Spearman fue 0,9077 (p < 0,001), considerándose no significativa una diferencia inferior a 0,5 en el log del número de copias/ml. En 3 muestras de las 39 positivas se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa (log del número copias/ml de ARN del VIH-1 > 0,5). Los parámetros estadísticos obtenidos fueron: media de la diferencia logarítmica (número de copias/ml) de 0,31, desviación estándar de la media de 0,23 y rango de la diferencia logarítmica de 0,546-0,074. Los datos de correlación lineal de ambas técnicas aparecen en la figura 1.
En nuestra experiencia la correlación entre el método Amplicor Monitor y NucliSens es muy buena, similar a la encontrada en estudios recientemente publicados5 y superior a la obtenida en otros trabajos revisados6,7.
No realizamos la diferenciación de posibles subtipos, aunque en la bibliografía consultada ambas técnicas detectan satisfactoriamente el subtipo B8, existiendo limitaciones en el caso de otros subtipos, principalmente A9,10, E y G9.
Respecto a la duración del ensayo, es similar en ambas técnicas (5 h ± 30 min para Amplicor Monitor y 6 h ± 30 min para NucliSens). No obstante, la realización de la técnica NucliSens conlleva mayor manipulación de las muestras, por lo que en laboratorios con jornada laboral de 7-8 h sería aconsejable dividir el proceso en dos fases ejecutables en días consecutivos.
En la actualidad existe la posibilidad de automatizar ambas técnicas en alguna de sus fases. En el caso de NucliSens es el proceso de extracción del ARN vírico, mientras que en Amplicor HIV-Monitor son las fases de amplificación y detección. En el primer caso se utiliza el aparato Xtractor adaptado a 10 muestras por ensayo en un tiempo de 50 min y en el segundo, el aparato Cobas Amplicor realiza la amplificación y detección de 24 muestras al mismo tiempo.
En conclusión, para laboratorios con jornada laboral de 7-8 h, carga de trabajo no superior a 10 muestras por ensayo y una sola persona para realizarlo, NucliSens es una alternativa válida para cuantificar la carga vírica del VIH-1. En otros supuestos, sería recomendable la utilización de una tecnología alternativa y/o la introducción de instrumentación que permita automatizar alguno o varios de los procesos del ensayo.
