INTRODUCCIÓN
Los péptidos opioides y sus receptores están implicados en las funciones neuroendocrinas y conductuales. Así, las encefalinas son agentes neuromoduladores en el sistema nervioso central de los roedores, actuando principalmente sobre los receptores opioides mu, que están ampliamente distribuidos en el prosencéfalo, principalmente en el estriado, el hipotálamo, el sistema límbico y las cortezas frontal, parietal y temporal1.
Se ha descrito que la afinidad de los receptores opioides localizados en las regiones hipotalámicas implicadas en la reproducción varía a lo largo del ciclo estral de la rata. Así, se ha sugerido que los opioides podrían regular el modelo pulsátil de secreción de LH2. Igualmente, se ha observado que el número de receptores mu en el prosencéfalo de la rata se incrementa en los comienzos del proestro3,4, y que presentan similares variaciones en el hipotálamo, sin cambios en la afinidad5.
A partir de estos datos, nos hemos centrado en la descripción de los posibles cambios en el número de células nerviosas que expresan el receptor opioide mu en el prosencéfalo de la rata, a lo largo del ciclo estral.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para la realización de este trabajo se emplearon ratas hembra Sprague-Dawley (n = 8), de 3 meses de edad, criadas en el Estabulario de la Universidad del País Vasco y mantenidas bajo condiciones controladas de iluminación (07.00 a 19.00 h) y temperatura (24 ºC), con acceso libre a comida y agua. Los animales fueron tratados cuidadosamente y todos los experimentos fueron llevados a cabo de acuerdo con la ley (Directiva 86/609/EEC de 24 de noviembre de 1986), evitando el sufrimiento. El ritmo del ciclo estral fue determinado mediante un examen diario del frotis vaginal; se seleccionaron los animales que tuvieron dos o más ciclos regulares, que fueron adscritos a 2 grupos: estro (a las 15.00 h) y proestro (a las 15.00 h). La hora del sacrificio de los animales se eligió basándose en el comienzo de la iluminación a las 7.00 h, dadas las importantes variaciones endocrinas que acontecen a lo largo del día del proestro. Tras la anestesia intraperitoneal con Equithensin (2 ml/kg) , una disolución alcohólica de nembutal e hidrato de cloral, se procedió a la apertura de la cavidad torácica, pinzamiento de la aorta descendente, apertura de la aurícula derecha y perfusión vía ventrículo izquierdo con tampón fosfato salino 50 mM, a un pH de 7,4, seguido de paraformaldehído al 4%, hasta conseguir una adecuada fijación de los tejidos. Los cerebros fueron extraídos, cortados en piezas de menor tamaño y sumergidos posteriormente en el mismo medio fijador durante toda una noche. Posteriormente, se mantuvieron durante 2 días a 4 ºC en una solución de sacarosa al 30%, con el fin de conseguir un grado adecuado de crioprotección. Seguidamente, se obtuvieron secciones coronales seriadas de 60 µ de espesor, utilizando un microtomo criostático, con la ayuda de un atlas estereotáxico. Estos cortes fueron posteriormente sometidos a un proceso de inmunomarcado del receptor opioide mu, empleando un anticuerpo específico policlonal elaborado en conejos. Los antígenos se detectaron mediante la técnica de la avidina-peroxidasa, usando 3, 3'-diaminobencidina como cromógeno. Tras la reducción de las peroxidasas endógenas con peróxido de hidrógeno al 1% y el bloqueo del ruido de fondo con suero de cabra al 5%, los cortes fueron incubados con los siguientes reactivos: a) anticuerpo primario: antirreceptor opioide mu, obtenido en conejo (Chemicon International Inc., Temecula, California, EE.UU.), policlonal, dilución 1:1.000; b) anticuerpo secundario biotinilado antigammaglobulina de conejo obtenido en cabra: (Chemicon International Inc., dilución 1:200); c) comple jo avidina-peroxidasa (strept ABC complex HRP, Dakopatts), y d) cromógeno (3,3'-diaminobencidina, Sigma). Cada paso fue seguido de un lavado por triplicado con una solución de tampón fosfato salino, empleándose habitualmente tritón X-100 al 0,5% para favorecer la penetración de los reactivos en el tejido. Finalmente, los cortes fueron extendidos de forma cuidadosa sobre portaobjetos previamente gelatinizados, deshidratados mediante inmersión en una batería de alcoholes de concentración creciente, montados con una resina transparente (DPX, Fluka), y examinados con un microscopio óptico Olympus BX50. La imagen del microscopio fue transformada en una señal de vídeo y posteriormente digitalizada. Para valorar la densidad de las células nerviosas teñidas positivamente se llevaron a cabo varios recuentos aleatorios en un área que previamente había sido delimitada con un cursor, con la ayuda de un sistema de análisis de imagen (Quantimet 500 MC, Leica). Todas las regiones cerebrales estudiadas se delimitaron con la ayuda de un atlas estereotáxico de cerebro de rata. Se realizaron al menos seis recuentos aleatorios de células inmunomarcadas positivamente para un área concreta de cada corte analizado, seleccionando no menos de 10 cortes para cada rata (n = 8). Los resultados obtenidos se expresaron como número de células inmunomarcadas positivamente para receptores opioides mu en un volumen de 1 * 105 µ m3 de tejido nervioso, en las fases de estro y proestro (media ± error estándar). Las diferencias entre las medias se calcularon mediante el test de la t de Student, considerándose estadísticamente significativas a partir de una p < 0,01.
RESULTADOS
Tras la realización del inmunomarcado del receptor opioide mu, se observaron abundantes células nerviosas intensamente teñidas, que alcanzaban una gran densidad en el estriado, la corteza cerebral y la región subcallosa. Concretamente, existían abundantes células redondeadas teñidas en las cortezas frontal, parietal y piriforme, así como en el giro dentado, el septum lateral y el caudado-putamen. Sin embargo, no se apreciaba con claridad la presencia de fibras teñidas en estas regiones.
Pudimos observar un aumento significativo en la densidad de células nerviosas inmunomarcadas en la fase de proestro, con respecto a la fase de estro, en la corteza piriforme (fig. 1) y el área preóptica medial del hipotálamo (fig. 2). Los resultados obtenidos se expresaron como el número de somas teñidos positivamente para el receptor opioide mu en 1 * 105 µ m3 de tejido nervioso (fig. 3), siendo este valor de 21,76 ± 3,08 en la corteza piriforme en la etapa de estro, 35,67 ± 4,55 en la corteza piriforme en la etapa de proestro, 23,20 ± 4,25 en el área preóptica medial del hipotálamo en la fase de estro y 37,33 ± 4,68 en el área preóptica medial del hipotálamo en el proestro.
DISCUSIÓN
Los receptores opioides mu están ampliamente distribuidos a lo largo del sistema nervioso central, principalmente en el estriado, el sistema límbico y las regiones corticales6. Esto concuerda con los resultados obtenidos en el presente trabajo, en los que se observa la presencia de abundantes células inmunomarcadas en las cortezas frontal, parietal y piriforme, el giro dentado y el caudado-putamen, con la utilización de técnicas inmunocitoquímicas7,8.
Debe destacarse la presencia de numerosas células redondeadas intensamente teñidas que expresan, por tanto, en su superficie el receptor opioide mu, en el área preóptica medial del hipotálamo (fig. 2). En este sentido, cabe recordar que los receptores mu situados en esta región presentan un dimorfismo sexual y están regulados por los esteroides sexuales9. Así, se ha demostrado previamente que el tratamiento con esteroides sexuales en ratas ovarioectomizadas genera una respuesta retardada, caracterizada por un incremento en el número de receptores opioides mu y en las concentraciones de betaendorfina. Además, estos esteroides generan un incremento simultáneo de los valores del ARNm de la proopiomelanocortina, precursor opioide, en las neuronas del núcleo arqueado, que proyectan sus fibras precisamente sobre otras regiones del hipotálamo10. Por otra parte, los receptores opioides mu parecen tener una particular relevancia en el control de la secreción hipofisaria de gonadotropinas y podrían estar implicados en la regulación de la secreción de LH11. Así, se ha descrito una relación inversa entre la liberación hacia los vasos portales de LH-RH hipotalámica y la de betaendorfina a lo largo del ciclo estral de la rata12. De igual forma, se ha observado que el tratamiento con esteroides sexuales aumenta la densidad de fibras nerviosas que expresan betaendorfina en el área preóptica medial hipotalámica de la rata ovariectomizada, sin grandes cambios en su distribución general13, lo que podría deberse al aumento del número de somas neuronales que expresan el precursor proopioiomelanocortina en el núcleo arqueado14.
En concordancia con todo ello, hemos observado un aumento significativo en la densidad de células nerviosas que expresan receptores opioides mu en la fase de proestro, con respecto al estro, en la corteza piriforme y en el área preóptica medial del hipotálamo. Estos datos concuerdan con los de otros trabajos que sugieren la participación de los opioides endógenos en la regulación del ciclo estral de la rata15,16, así como el posible papel de los receptores opioides mu prosencefálicos en la regulación de la secreción de gonadotropinas.
AGRADECIMIENTO
Este trabajo ha sido parcialmente subvencionado por el FIS (98/0028-00) y el Gobierno Vasco (PI97/37). Agradecemos al Prof. Ismael Barbero su asesoramiento estadístico y a J.M. Rodríguez Robledo su asistencia técnica.