Se revisan los conocimientos actuales sobre el receptor de la hormona de crecimiento (GHR) humano, exponiendo en primer lugar sus características estructurales, su forma soluble en la circulación y la distribución tisular del receptor. Así mismo, se describen las características hasta ahora conocidas del gen de este receptor y sus isoformas. Por último, se analizan los datos existentes sobre los mecanismos de regulación de la expresión de este gen, por su propia hormona, por la proteína ligadora de la hormona de crecimiento (GHBP), por glucocorticoides y estrógenos.
La hormona de crecimiento (GH) posee una variedad de efectos biológicos en un número considerable de tejidos diana, particularmente efectos metabólicos y de crecimiento sobre el esqueleto y los tejidos blandos.
Las acciones de la GH a nivel celular, tales como efectos mitogénicos, efectos metabólicos insulínicos y antiinsulínicos, así como las acciones reguladoras de su propio gen, están mediadas por receptores. El receptor de la GH (GHR) pertenece a la misma familia de los receptores de prolactina y a muchos receptores de la superfamilia de la citocina/hematopoyetina1.
Los receptores de esta superfamilia tienen en común un dominio extracelular, involucrado en la unión al ligando, una porción transmembranal y un dominio intracelular de longitud variable.
RECEPTOR DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANO
Este receptor fue clonado por primera vez en 1987 por Leung et al2, a partir de una genoteca de ADNc hepático humano. Consta de una glucoproteína de cadena simple que contiene 620 aminoácidos, con un peso molecular de 110.000 D. Posee un dominio extracelular compuesto de 246 aminoácidos, un dominio transmembranal de 24 aminoácidos y un dominio citoplasmático constituido por 350 aminoácidos2. El dominio extracelular contiene dos pares de cisteínas unidas por puentes disulfuro y un motivo WS (Trp-Ser-X-Trp-Ser) característico de los receptores de la superfamilia de la citocina. En el dominio citoplasmático, cercano a la membrana, se encuentra una porción compuesta por 8 aminoácidos, rica en prolina, indispensable en importantes funciones como síntesis proteica y lipídica, así como en el transporte de glucosa.
Una característica particular del dominio extracelular es que también se encuentra en el suero como una proteína soluble ligadora de GH, denominada GHBP3. Esta proteína posee una alta afinidad por la GH y es idéntica desde un punto de vista antigénico al receptor de membrana de la GH4. El análisis directo de su secuencia aminoacídica demostró correspondencia con el dominio extracelular del GHR que está involucrado en la unión a la hormona2 (fig. 1).
El conocimiento de que la GHBP se encuentra en la sangre y que esta proteína representa el dominio extracelular del receptor de la GH abrió nuevas y accesibles vías para el estudio de este receptor en humanos.
CARACTERISTICAS DE LA GHBP
La GHBP fue descrita por primera vez en el plasma circulante humano en 1986 por Baumann et al5 y Herington et al6. Es una glucoproteína de cadena simple compuesta de 246 aminoácidos y con un peso molecular de 60 kD. Posee una serie de propiedades que le permiten unirse a la GH in vivo, como son: alta especificidad, alta afinidad, una tasa de asociación rápida y una limitada capacidad.
La GHBP en el hombre (y conejo) es generada por una rotura proteolítica del GHR unido a la membrana. El sitio preciso de rotura, así como la proteasa responsable para generar la GHBP, es desconocido hasta el momento. Ninguna de las proteasas clásicas parece estar involucrada. Se ha apuntado que el grupo sulfidrilo de una cisteína libre localizada en la región de la rotura podría desempeñar un papel importante en la proteólisis7. En estudios utilizando líneas celulares de hepatoma humano transfectadas con el ADNc del GHR de conejo, en las que se ha analizado un amplio número de inhibidores de proteasas, tampoco se han obtenido resultados concluyentes8,9. Un reciente trabajo describe que la liberación de la GHBP a un medio de linfocitos humanos IM-9 es bloqueada por medio de un inhibidor de una metaloproteasa, implicando a miembros de la familia de las metaloproteasas en la generación de la GHBP10.
La función de la GHBP es poco conocida, pero el hecho de que esté presente en el suero humano a concentraciones suficientes para unirse a la GH en una proporción del 30-50%11 sugiere que puede tener un determinado papel biológico. Numerosas propuestas han sido hechas en apoyo de esta hipótesis. Así, Baumann et al11 demostraron que la GHBP incrementa la vida media de la GH disminuyendo su tasa de aclaramiento metabólico. Los estudios de Veldhuis et al12 evidenciaron que la GHBP circulante actúa, de alguna manera, frenando la secreción pulsátil de la GH y elevando la GH libre durante los períodos de interpulso, actuando como un reservorio de la hormona. Aunque estas acciones parecen incrementar la biopotencia de la GH in vivo13, in vitro la GHBP se une a la GH formando un complejo e inhibiendo de esta forma la unión de la hormona a sus receptores en los tejidos diana y ciertas respuestas dependientes de GH, tales como mitogénesis y diferenciación14.
Otros importantes aspectos acerca de lo que se conoce de este fragmento circulante del GHR, en los que no entramos en esta revisión, están recogidos en trabajos y revisiones nuestros y de otros autores3,15-21.
DISTRIBUCION TISULAR DEL RECEPTOR DE GH
El GHR humano ha sido estudiado principalmente en el hígado, donde se han encontrado sitios de unión somatogénicos en cantidades suficientes que permitan una medida exacta por análisis de radiorreceptores22,23. En grado menor, también se han descrito sitios de unión de la GH a fibroblastos humanos24, células mononucleares periféricas25 y adipocitos26, pero estos estudios no han sido siempre reproducibles. Así mismo, por análisis inmunohistoquímicos se ha demostrado la existencia del GHR en piel humana y fibroblastos27.
Por estudios en animales, en donde se han demostrado sitios de unión específicos para la GH en una más amplia variedad de tejidos28, se ha sugerido la existencia de subtipos del GHR que podrían estar asociados con las múltiples acciones biológicas de esta hormona. En apoyo de esto, existen estudios de inmunoprecipitación y cross-linking en hígado, glándula mamaria y adipocitos de conejo29-30, hígado de ratón31 y una línea celular de insulinoma de rata32, que sugieren la posible existencia de tales formas del GHR.
GEN DEL RECEPTOR DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO
El gen del GHR está presente en el genoma como una sola copia en todas las especies estudiadas y en el genoma humano se encuentra localizado en la región correspondiente a las posiciones 13.1-12 del brazo corto del cromosoma 5 (5p13-p12) con una longitud de al menos 87 kb33.
La caracterización de la estructura del gen del GHR34 reveló la existencia de 8 exones que codifican para el receptor y varios exones adicionales en la región 5' no traducida. Estos 9 exones que comprenden también la región 3' no traducida son numerados del 2 al 10. Los exones del 2 al 9 están constituidos por pares de bases de tamaño variable que van desde 66 a 179 pb. El exón 2 es prácticamente coincidente con la secuencia señal para la secreción putativa del receptor. La región extracelular del receptor que tiene la capacidad de unirse a la GH está codificada por los exones 3 al 7. El exón 8 se corresponde con el dominio transmembranal y el exón 10 codifica casi todo el dominio citoplasmático del receptor, así como a la región 3' no traducida, y comprende alrededor de 3.400 pb. La mayor parte de la región 5' no traducida parece estar presente en series de exones procesados de forma alternativa que no han sido aún determinados (fig. 2).
ARNm(s) DEL GEN DEL RECEPTOR DE HORMONA DE CRECIMIENTO
Se ha demostrado que en el hombre, el conejo y otras especies, el principal transcrito del gen del GHR es un ARNm de alrededor de 4,5 kb detectado por análisis Northern. En el hombre, la expresión de este transcrito ha sido detectada principalmente en el hígado, pero también en diferentes zonas del aparato digestivo tales como esófago, intestino y colon, y en fibroblastos27,35 y en algunas líneas celulares como IM-9, HuH7 y hOB. Por el contrario, se ha demostrado que en ratas y ratones existen dos ARNm(s), uno de 4,5 kb que codifica para el receptor de longitud completa y otro de alrededor de 1,2-1,5 kb que codifica exclusivamente para la porción extracelular36,37. Las dos especies han sido encontradas principalmente en tejido hepático, así como en numerosas líneas celulares.
ISOFORMAS DEL GEN DEL RECEPTOR DE HORMONA DE CRECIMIENTO
El exón 3 del gen del GHR humano, por un procesamiento alternativo, da lugar a dos isoformas del receptor: uno que codifica para el receptor de longitud completa (GHR+3), y el otro que codifica para un receptor al que le falta el exón 3 (GHR-3) con una deleción de 22 aminoácidos (residuos del
7 al 28) en el dominio extracelular del receptor. Hay evidencias de que esta pérdida de aminoácidos no tiene un impacto aparente sobre la unión al ligando o a las señales de transducción38-40.
Los primeros estudios evidenciando estas dos isoformas fueron realizados en tejidos humanos de placenta, hígado, riñón y leptomeninges, así como en algunas líneas celulares. Urbanek et al38 encontraron que, en el hígado y riñón, únicamente se expresaba la isoforma GHR+3, mientras que en la placenta, villi y amnion, estaba presente sólo la isoforma GHR-3, concluyendo que las dos isoformas eran específicas de tejido. Posteriormente, Sobrier et al39 encontraron que ambas isoformas se expresaban igualmente en hígado, tejido mamario y placenta, mientras que en la próstata, pulmón y tejido adiposo el transcrito predominante era GHR+3. En estos estudios, se utilizó una sola clase de primers sense/antisense para detectar las dos isoformas. En un trabajo realizado por nuestro grupo utilizando un primer antisense común a las dos isoformas y dos primers sense diferentes, diseñados para reconocer específica e independientemente cualquiera de las dos isoformas, se encontró que en los 18 tejidos examinados estaban presentes las dos isoformas y que las proporciones de cada una variaba considerablemente dependiendo del tejido41 (tabla 1). Por otro lado, hay trabajos que encuentran que la expresión de las dos isoformas varía entre individuos, mientras que diferentes tejidos de un mismo sujeto muestran un similar patrón de expresión42. Más recientemente, el estudio de Zogopoulus et al43 en tejidos humanos fetales y posnatales describe que las dos isoformas están presentes ya en el primer trimestre de la vida fetal en múltiples tejidos y que el patrón de expresión de estos transcritos es específico de individuo y puede ser regulado por el desarrollo.
Las disparidades existentes entre los diferentes estudios acerca de estas dos isoformas, independientemente de que puedan deberse a razones técnicas, sugieren que el procesamiento alternativo del exón 3 podría también estar determinado por factores distintos a los relacionados con especificidad de tejido, tales como condiciones metabólicas. Además, queda por determinar su significación fisiológica o en qué grado la expresión diferencial de estas dos isoformas desempeña un papel en la modulación de los numerosos efectos de la GH.
Cabe mencionar, por último, que recientes estudios han identificado una tercera isoforma del gen del GHR en varios tejidos humanos. Su secuencia es idéntica a la del GHR, con la excepción de una deleción de 26 pb en la porción citoplasmática del receptor que lleva a la creación de un codón stop en la posición 280 aminoacídica y, en consecuencia, a una proteína-receptor gravemente truncada con pérdida del 97,5% del dominio intracelular44,45.
REGULACION DE LA EXPRESION DEL GEN DEL RECEPTOR DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANO
El conocimiento sobre la regulación de la expresión del gen del GHR humano es todavía escaso, mientras que la mayoría de los datos existentes a este respecto son los derivados de estudios del gen del GHR en animales. No obstante esto, en este apartado nos vamos a referir exclusivamente a los datos en humanos.
Regulación por la hormona de crecimiento
Los efectos de la GH sobre la regulación de la expresión del gen de su propio receptor han sido analizados en la línea celular del hepatoma humano HuH746. En estos experimentos, las células fueron tratadas con diferentes dosis de GH humana a determinados tiempos, después de lo cual se midieron las concentraciones del ARNm del GHR por RNAase protection assays empleando una sonda que codifica para las regiones transmembranal y citoplasmática del receptor. Las células tratadas con GH a concentraciones fisiológicas (12,5, 25 y 50 ng/ml) dieron como resultado un aumento en las concentraciones del ARNm del GHR dentro de las primeras 3 h de adición de la hormona, aumento que se mantuvo estable hasta al menos 48 h. Por el contrario, el tratamiento con concentraciones tanto suprafisiológicas de GH (150 y 500 ng/ml) como intrafisiológicas (1,4 ng/ml) llevó primero, en el caso de dosis altas de GH, a una disminución transitoria llegando a un nadir en las primeras 3 h, a partir de lo cual la expresión fue restaurada, presentando posteriormente un progresivo aumento de la expresión del gen, y en segundo lugar, en el caso de dosis muy bajas de GH, las concentraciones de ARNm del GHR presentaron una disminución constante, en las condiciones del estudio46.
Por análisis nucleares run-on assays, que fueron realizados por estos autores bajo las mismas condiciones de tiempo de los empleados para medir las concentraciones de ARNm, se constató que los cambios en la expresión del gen del GHR tras el tratamiento con GH eran debidos a alteraciones en su tasa de transcripción génica. El tratamiento con cicloheximida no modificó significativamente los cambios observados en la tasa de transcripción, lo que indicaría que el incremento no es dependiente de una nueva síntesis proteica.
En un trabajo posterior47, estos mismos autores realizaron una serie de experimentos similares, pero esta vez utilizando una sonda correspondiente al dominio extracelular del receptor que codifica para la GHBP. Los resultados indicaron que los cambios producidos en las concentraciones del ARNm del GHR por efecto del tratamiento con GH eran idénticos a los detectados anteriormente usando la sonda que codificaba a las secuencias transmembranales y citoplasmáticas del GHR. Estos datos corroboran, por un lado, que la GH es capaz de regular el gen de su propio receptor, siendo esta regulación dependiente de dosis y tiempo y, por otro, que en humanos el dominio extracelular (GHBP) y los dominios transmembranal/citoplasmático del GHR son codificados por un solo ARNm del gen del GHR.
Regulación por la GHBP
Como se ha mencionado anteriormente, la GHBP es una variante truncada del GHR. El hecho que esta proteína no es solamente conservada a través de la evolución, sino que también es producida por diferentes mecanismos, lleva a la presunción de que tiene una importante función biológica. Con el objeto de estudiar si la GHBP sérica desempeña un papel activo dentro de la acción de la GH y si es capaz de regular la transcripción génica del GHR, los investigadores antes citados46,47 han examinado recientemente el efecto de diferentes concentraciones de GHBP y GH contenidos en el suero de pacientes con síndrome de enanismo tipo Laron (LTD), patología que cursa generalmente con concentraciones normales o altas de GH y bajas o ausentes de GHBP sobre las concentraciones de ARNm del GHR. El suero fue añadido al medio de cultivo de células hepáticas humanas HuH7 y la expresión del gen del GHR fue analizada después de 3 h de la adición del suero a las células48. En el suero de los pacientes con LTD que contenían tanto concentraciones de GH muy altas (media: 128 ng/ml) como normales-bajas (media: 1,4 ng/ml) y ausencia de GHBP, se observó una disminución de los niveles de expresión del gen del GHR, después de las 3 h de incubación, corroborando los experimentos citados anteriormente sobre la regulación del GHR por su propia hormona46,47.
El efecto de altas concentraciones de GHBP sobre la transcripción génica del GHR fue observada en un grupo de pacientes obesos que cursaban con bajas concentraciones
de GH (inferior a 0,5 ng/ml) y altos valores de GHBP (2,5 veces por encima del rango normal). En estos experimentos, se observó un descenso aún más pronunciado en las concentraciones del ARNm del GHR. Estos datos indicarían que la GHBP podría tener algún efecto sobre la transcripción génica del GHR.
Regulación por glucocorticoides
Es conocido que mientras concentraciones altas de glucocorticoides causan osteoporosis, la GH a concentraciones fisiológicas es necesaria para una normal remodelación ósea49-51. Por esto, el estudio de la interacción de la GH y los glucocorticoides en la regulación del metabolismo óseo humano tiene gran interés. En este sentido, se ha demostrado que en células osteoblásticas humanas cultivadas (hOB) hay receptores de GH y que esta hormona a través de estos receptores ejerce una acción estimuladora directa sobre la formación del hueso52-54.
Recientemente, Swolin-Eide et al55 han estudiado el efecto del cortisol sobre la expresión del gen del GHR en células hOB. En estos experimentos, las células fueron incubadas con diferentes concentraciones de cortisol por un período de 16 h, después de lo cual se midieron las concentraciones de ARNm del GHR por RNAase protection assay, utilizando una sonda que reconoce el dominio intracelular del receptor de GH. Los resultados indicaron un incremento en las concentraciones del ARNm del GHR, que fue dependiente de la dosis utilizada, observándose el máximo efecto a una concentración de 106 M. Además, este efecto estimulador del cortisol sobre la expresión del gen del GHR fue también dependiente del tiempo, y se observó el máximo incremento a las 12 h después de la adición de la hormona. El incremento en las concentraciones de ARNm del GHR fue acompañado por un aumento de la unión de 125I GH a sus receptores en estas células, alcanzando el valor máximo a las 24 h.
Estos resultados demuestran, por primera vez, los efectos de los glucocorticoides sobre la expresión del gen del GHR en células humanas y abren una nueva vía a posteriores estudios encaminados a clarificar si la regulación en la expresión del gen del GHR mediado por glucocorticoides puede tener importancia en la fisiología ósea humana.
Regulación por estrógenos
Como ya hemos dicho en el párrafo anterior, la GH es un factor importante en la regulación de la masa ósea. Se ha observado que pacientes con deficiencia de GH tienen una masa ósea reducida51,56, que puede ser tratada con una terapia de sustitución de GH51. Por otro lado, es conocido que la pérdida de masa ósea en mujeres posmenopáusicas es debida principalmente a una deficiencia estrogénica.
Recientemente, Slootweg et al57 han presentado la primera evidencia de que los estrógenos en células osteoblásticas humanas son capaces de estimular tanto la unión de la GH a sus receptores como las concentraciones del ARNm del GHR, así como la actividad proliferativa de la GH en estas células. El efecto estimulador del 17 ß -estradiol fue dependiente de dosis y tiempo, alcanzando un efecto máximo a las 12 h de incubación de las células con una concentración de 1012 M de 17 ß -estradiol.
Esta modulación positiva inducida por los estrógenos indicaría que estas hormonas potencian el efecto de la GH en el receptor.
CONCLUSIONES
En conclusión, hemos revisado los datos existentes sobre el GHR humano, comentando los principales aspectos de su estructura, niveles de expresión y regulación génica.
Dado que los estudios más extensos de este receptor están realizados en animales y que los datos existentes en humanos, especialmente los referidos a mecanismos de regulación génica, son escasos, sería necesario el desarrollo de nuevas líneas celulares humanas que aportarán modelos útiles para clarificar la regulación del receptor hormonal.