Objetivo. En el presente estudio se ha investigado los efectos causados por las LDL nativas, mínimamente modificadas y oxidadas sobre la morfología y ultraestructura plaquetaria.
Metodos. Mediante un nuevo procedimiento analítico, las plaquetas presentes en plasmas ricos (PRP) de individuos normolipémicos fueron aisladas utilizando filtros de membranas no reactivas de polivinilpirrolidona montados en cámaras Swinex-25. Posteriormente, los cambios morfológicos y ultraestructurales causados por los diferentes agentes estimuladores fueron evaluados mediante microscopia electrónica de rastreo (MER) y de transmisión (MET).
Resultados. En nuestras condiciones experimentales, las plaquetas en estado de reposo, es decir, no estimuladas por ningún agonista, presentaron una completa integridad en todas sus áreas y regiones principales. Por contra, la estimulación con trombina a bajas concentraciones (0,01 U/ml) permitió observar la existencia de un estado de activación transicional, mientras que a concentraciones superiores (0,1 U/ml) el mismo agonista produjo intensos cambios morfológicos y ultraestructurales. El efecto de las lipoproteínas fue dependiente del tipo de partícula. Las LDL nativas (0,5 g de proteína/l) causaron una rápida transición de las típicas formas de reposo a un estado de uniformidad morfológica caracterizado por la pérdida del contorno liso de la superficie plasmática y la adopción de formas redondeadas con emisión de pequeños seudópodos. El estudio de la ultraestructura plaquetaria permitió observar la existencia de moderada centralización granular, dilución del contenido de los gránulos, desorganización microtubular y fusión saculocanalicular. Las LDL mínimamente modificadas (0,1 g de proteína/l) causaron intensos efectos citotóxicos sobre las membranas plasmáticas. Por otra parte, los cambios morfológicos y ultraestructurales inducidos por este tipo de partículas fueron más intensos que los producidos por las LDL nativas. Finalmente, las LDL oxidadas (0,1 g de proteína/l) causaron profundos cambios morfológicos y ultraestructurales, caracterizados por emisión de seudópodos, vacuolización, centralización granular, pérdida de organelas, conexiones entre el sistema canalicular abierto y el sistema tubular denso y desorganización microtubular. Sin embargo, las LDL oxidadas apenas presentaron efectos citotóxicos.
Conclusión. Nuestros resultados demuestran por primera vez que en condiciones in vitro las LDL, tanto nativas como mínimamente modificadas u oxidadas, son capaces de inducir intensos cambios morfológicos y ultraestructurales en las plaquetas humanas, lo que apoya la hipótesis del papel trombomodulador de las LDL.
Objective. We have investigated the effects of native and modified LDL (minimally modified and oxidized LDL) on platelet morphology and ultrastructure.
Methods. Platelets from normocholesterolemic subjects were isolated by a new noncentrifugative method combined with scanning and transmission electron microscopy.
Results. Under our experimental conditions, the morphology of resting platelets was fully preserved. On the other hand, thrombin at low concentrations (0.01 U/ml) induced a transitional platelet activated state, whereas at higher concentrations (0.1 U/ml) it caused profound changes in the morphology and the ultrastructure of platelets. The effect of LDL particles (native and modified) on the functional morphology of human platelets was investigated by means of transmission and scanning electron microscopy. Platelets stimulated by native LDL (0.5 g/l), showed disc-sphere transformation with pseudopodia and centralization of granules. A cytodamage in platelet membrane was induced by minimally modified LDL (0.1 g/l), leading to a lower electron density of cytoplasm compared to control platelets. Furthermore, centralization of granules and significant changes in the morphology and ultrastructure of platelets were observed. Finally, oxidized LDL at a concentration of 0.1 g/l induced more obvious functional morphological alterations of platelets than those caused by native and minimally modified LDL.
Conclusion. Our results demonstrate for the first time fhart in vitro both native and minimally modified or oxidized LDL are able to induce profound morphological and ultrastructural changes in human platelets, thus supporting a thrombomodulator role for LDL.
Introducción
Actualmente, los datos de que disponemos parecen indicar que las cifras elevadas de colesterol plasmático producen alrededor de las placas arterioscleróticas un microambiente trombogénico que puede favorecer el desarrollo de las lesiones y la aparición de futuras complicaciones trombóticas1-3. Durante la última década, numerosas evidencias han demostrado la existencia de importantes interrelaciones entre las lipoproteínas plasmáticas, las plaquetas y diferentes factores de la coagulación y de la fibrinólisis4-6. En conjunto, todos estos datos han reforzado el papel que desempeñan las alteraciones del metabolismo lipídico en la trombogenicidad de las lesiones arterioscleróticas. Una de las áreas que está siendo sometida a una intensa y profunda investigación es el campo de la hiperreactividad plaquetaria que caracteriza a los individuos hipercolesterolémicos7. Durante la última década, diversos estudios han descrito múltiples alteraciones funcionales en las plaquetas de este tipo de pacientes, entre las que destacan: aumento de la reacción de liberación del contenido granular, incremento en la formación plaquetar de tromboxano A2 e hiperadhesividad8-10. Al parecer, todas estas alteraciones funcionales están relacionadas con el enriquecimiento en colesterol y ácido araquidónico de las membranas plasmáticas plaquetarias11. Múltiples estudios in vitro han demostrado que, cuando las plaquetas de individuos normolipémicos se incuban en presencia de concentraciones fisiológicas de LDL nativa, la agregación inducida por diferentes agonistas aumenta significativamente12,13. Por otra parte, cuando las plaquetas se incuban en presencia de concentraciones suprafisiológicas de LDL nativa14 o con LDL oxidada15-17 puede tener lugar la agregación espontáneamente, es decir, en ausencia de agonistas, lo cual indica que en estas circunstancias las partículas lipoproteicas podrían actuar como clásicos agonistas de la agregación plaquetaria. Este tipo de efecto directo mediado por las lipoproteínas parece estar determinado por receptores específicos de membrana18-21. Diferentes estudios han demostrado la implicación del sistema de transducción de la señal mediado por la hidrólisis de fosfatidilinositol, formación de diacilglicerol y liberación de calcio citoplasmático22-24. Recientemente25, se ha descrito que esta respuesta celular estaría mediada por receptores de membrana acoplados a proteínas G que son susceptibles de ser regulados mediante el fenómeno de desensibilización y modulación de la respuesta por mecanismos de regulación a la alta/baja del número de receptores23,25,26. Sin embargo, hasta la fecha no disponemos de estudios que hayan permitido evaluar en profundidad el grado de las alteraciones morfológicas y ultraestructurales inducidas por las lipoproteínas. En el presente estudio, mediante microscopia electrónica de rastreo y de transmisión, se ha investigado el grado y tipo de las alteraciones morfológicas y ultraestructurales plaquetarias que tienen lugar tras la estimulación mediada por las partículas de LDL nativas, mínimamente modificadas y oxidadas.
Material y métodos
Materiales
Los filtros de membrana de polivinilpirrolidona (PVP) de un tamaño promedio de poro de 0,8 µ m y las cámaras Swinex-25 fueron de Millipore (Madrid, España), el tetraóxido de osmio fue de Agar Scientific, Ltd. (Stansted, Reino Unido), la trombina, NH4Cl, la aprotinina, el cloramfenicol y la PGE1 procedieron de Sigma Chem (St. Louis, MO, EE.UU.), las columnas de Sephadex PD-10 de Pharmacia LKB (Uppsala, Suecia) y el EDTA, glutaraldehído y paraformaldehído fueron de Merck (Darmstadt, Alemania).
Aislamiento de la LDL
La LDL (densidad = 1,019-1,063 g/ml) fue obtenida a partir de un acervo de sueros procedente de extracciones sanguíneas realizadas a voluntarios sanos normolipémicos. El aislamiento de la LDL nativa (LDLn) se realizó mediante una ultracentrífuga Centrikon T 2060 (Kontron Ins. Milán, Italia) siguiendo un procedimiento separativo de ultracentrifugación secuencial24. La LDL durante su flotación fue lavada con una solución de KBr de densidad 1,063 g/ml y, posteriormente, el exceso de KBr se eliminó mediante cromatografía de gel de exclusión utilizando columnas PD-10, previamente equilibradas con tampón Tris salino (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,45, que contenía 0,3 mM EDTA). La concentración de la LDL se expresó en términos de su contenido en apo B determinado mediante inmunoturbidimetría (Boehringer-Mannheim, Alemania). La movilidad electroforética y el grado de fragmentación de la apo B se determinaron mediante procedimientos separativos electroforéticos en gel de agarosa-acrilamida (Lipofilm, SEBIA, Francia) y SDS-PAGE.
Modificación de la LDL
La modificación oxidativa de los residuos de lisina de la apo B de la LDL (LDLox) se obtuvo mediante reacción con sulfato de cobre, siguiendo el procedimiento descrito previamente18. Las partículas de LDL mínimamente modificadas (LDLmm) se obtuvieron siguiendo el procedimiento descrito previamente28. El grado de modificación de las partículas lipoproteicas fue evaluado mediante la determinación del contenido en las partículas de las sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico (TBARS), hidroperóxidos y vitamina E. Por otra parte, el grado de variación en la carga eléctrica de las partículas, así como la fragmentación de la apo B, se determinó por electroforesis en gel de agarosa-acrilamida (Lipofilm, SEBIA, Francia), y SDS-PAGE, respectivamente.
Obtención de las plaquetas
Las plaquetas se aislaron a partir de sangre anticoagulada con citrato sódico al 3,8%, que contenía 5 µ mol/l de PGE1. Las extracciones sanguíneas fueron realizadas a voluntarios sanos normolipémicos que no habían tomado ningún fármaco antiplaquetario al menos durante los 3 meses anteriores a la extracción. El proceso de extracción siempre fue realizado sin estasis venosa, es decir, sin emplear ningún tipo de compresión y realizándose el procesamiento de los especímenes siempre inmediatamente después de la extracción sanguínea. Todos los procedimientos fueron realizados a temperatura ambiente. El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtuvo después de centrifugar a 200 g durante 6 min a temperatura ambiente siguiendo el procedimiento previamente descrito16.
Fijación de las plaquetas
Sobre un filtro de membrana de PVP de tamaño medio del poro de 0,8 µ m, montado en una cámara Swinex-25 con el orificio inferior tapado, se dispensaron 0,490 ml de la solución prefijadora (glutaraldehído al 0,1%, v/v en tampón de Tyrode [0,14 mol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 1 mmol/l CaCl2, 12 mmol/l NaHC03, 0,4 mmol/l NaH2P04, 5,5 mmol/l glucosa, 10 mmol/l HEPES, pH 7,45, conteniendo 5 µ mol/l PGE1]) en algunos experimentos también fue utilizado como tampón del prefijador el tampón 0,1 M fosfato sódico pH 7,4, conteniendo igualmente 5 µ mol/l PGE1. Posteriormente, 0,01 ml del PRP fueron dispensados suavemente sobre el prefijador y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante 10-15 min. El efecto de las lipoproteínas (LDLn, LDLmm y LDLox) y de los agonistas (trombina) se determinó incubando previamente, a temperatura ambiente y en ausencia de prefijador, 0,01 ml del PRP con idéntico volumen de los citados agentes, realizándose la prefijación siguiendo el procedimiento descrito con anterioridad. Después de la prefijación se permitió que la mezcla de incubación drenara pasivamente (destapando el orificio inferior de la cámara Swinex-25). Posteriormente, se volvió a cerrar de nuevo la cámara Swinex-25 y se procedió inmediatamente a la refijación de las muestras dispensando muy suavemente 0,5 ml de una solución de glutaraldehído al 3% en tampón 0,1 M fosfato sódico pH 7,4 e incubando a temperatura ambiente durante 30-45 min. Después permitir el drenaje pasivo de la solución fijadora, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, las membranas se lavaron tres veces, dispensando de forma muy suave y dejando drenar pasivamente 1 ml de tampón Tyrode o fosfato sódico 0,1 M, según se tratará el experimento en cuestión. Posteriormente, se procedió a cerrar la cámara Swinex-25 y se llevó a cabo la posfijación durante 1 h a 4 °C mediante reacción con tetraóxido de osmio al 1% en tampón 0,1 M fosfato sódico pH 7,4. En determinados experimentos el PRP se fijó mediante un procedimiento similar, pero utilizando como fijador una solución de glutaraldehído al 0,1% y paraformaldehído al 2% (v/v) en tampón fosfato 0,1 M, seguido de posfijación por reacción con cloruro de amonio (150 mM).
Preparación de las muestras para microscopia electrónica
Después de la posfijación se procedió a deshidratar las muestras. En el caso de las muestras para su posterior identificación por microscopia electrónica de transmisión (MET), se dispensó muy suavemente con pipeta pasteur diferentes soluciones alcohólicas a concentraciones crecientes (desde el 30 hasta el 100%), seguidas finalmente por soluciones de acetona al 100%. Posteriormente, las muestras deshidratadas fueron incluidas en resina Spurr que fue polimerizada a 60 °C durante 48 h. Los cortes semifinos (0,7 µ m) y los ultrafinos (60 nm) se realizaron con un micrótomo ultracutE (Reichert Jung, Alemania), los ultrafinos se recogieron en rejillas de cobre empleando el mismo instrumento. El contraste de las muestras se llevó a cabo con acetato de uranilo al 2% y nitrato de plomo y citrato sódico. En el caso de las muestras cuyo destino final era su identificación por MER, la deshidratación se realizó con sucesivos pasos de soluciones con concentraciones crecientes de alcohol pero seguidas por una serie de soluciones con concentraciones crecientes de isoamil acetato. Posteriormente, la desecación de las muestras se realizó por el método del punto crítico con CO2 mediante el equipo Bat-tec CPD 030 (Liechtenstein), y el montaje se llevó a cabo mediante cinta bioadhesiva de carbón en un soporte de aluminio. Finalmente, las muestras fueron recubiertas por una película de oro de 25 nm de grosor en un equipo de pulverización catódica (Bal-tec SCD 004) siguiendo procedimientos habituales.
Microscopia electrónica
Las muestras para MET fueron observadas a 40 y 60 KV en un microscopio electrónico Zeiss EM 10CA (Zeiss, Alemania), mientras que las muestras para MER lo fueron a 15 KV en un microscopio Jeol EM 6400 (Jeol, Japón).
Resultados
Plaquetas en reposo (no estimuladas)
En nuestras condiciones experimentales, las plaquetas en estado de reposo, presentaron al MER una evidente heterogeneidad de tamaño, así como una variada morfología con formas discoidales, fusiformes y elipsoidales (fig. 1). Las plaquetas fusiformes de pequeño tamaño (eje mayor de 1,5 a 2,5 µ m) fueron las más abundantes, mientras que las plaquetas discoidales y elipsoidales de mayor tamaño (eje mayor de 2,5 a 6 µ m) fueron mucho menos numerosas. También se pudieron observar claramente los finos detalles de la superficie plaquetaria. En condiciones de reposo las plaquetas humanas presentaron un contorno superficial liso con total ausencia de prolongaciones citoplasmáticas filopódicas y/o de emisión de pequeños seudópodos. No obstante, se pudo apreciar a lo largo de su contorno superficial la presencia de pequeñas incisuras o invaginaciones que, como es bien conocido, representan el lugar donde los canales del sistema canalicular abierto (SCA) comunican con la superficie celular. Mediante MET y con las técnicas de fijación utilizadas en el presente estudio, los elementos estructurales del área periférica, especialmente la membrana plasmática y el SCA pudieron ser completamente identificados (fig. 2). En la MET las plaquetas en reposo presentaron la típica membrana celular trilaminar semejante a la de otros tipos celulares y el SCA formado por una serie de canales y vacuolas carentes de densidad electrónica, presentaba en algunas secciones continuidad con la superficie celular, demostrando claramente su origen a partir de invaginaciones de la membrana citoplasmática periférica. El aspecto que dotaron a las plaquetas el entramado formado por invaginaciones, canales y vacuolas fue similar al de una esponja, en la que su área de superficie estaba claramente aumentada comparada, por ejemplo, con una esfera de similares dimensiones. En algunas pocas secciones plaquetarias, los canalículos del SCA formaron acumulaciones a modo de racimos que sufrían interdigitaciones con los canales del sistema tubular denso (STD), formando complejos membranosos íntimamente relacionados con los gránulos de secreción. El STD, que junto con el SCA forman el sistema de membranas de las plaquetas, adoptó una distribución diseminada por todo el citoplasma, correspondiendo a la típica imagen de una preparación de plaquetas en estado de reposo. Por otra parte, se pudo observar cómo los canales del STD eran más cortos y más estrechos que los del SCA, que contenían un material amorfo de electrodensidad similar a la del citoplasma circundante. En ningún caso se observó en nuestras preparaciones la existencia de comunicación directa entre el STD y la membrana plasmática. No obstante, sí que se apreció conexión directa entre el STD y el sistema microtubular, así como una estrecha relación con los gránulos de secreción. Respecto a los constituyentes de la segunda región plaquetaria, es decir, del área sol-gel o matriz citoplasmática, las secciones paralelas al plano ecuatorial pusieron de manifiesto cómo los microtúbulos, cuyo diámetro osciló entre 20 y 25 nm, se disponían en haces de 5 a 10 de un modo circunferencial por debajo de la membrana periférica. Sin embargo, la mayoría de los cortes atravesaron perpendicularmente el plano ecuatorial, permitiendo observar los microtúbulos con el aspecto de estructuras redondeadas vacías localizadas en ambos extremos de la plaqueta. Respecto a los agregados de glucógeno, éstos pudieron ser observados en forma de pequeñas partículas individuales electrónicamente densas dispersas por toda la matriz, aunque también en forma de pequeños agregados de partículas densamente empaquetadas y de igual forma dispersas irregularmente por la matriz. Respecto al área de organelas, todas ellas claramente separadas de la membrana plasmática periférica, se pudo observar la presencia de pequeñas mitocondrias con formas redondeadas u ovoides y de un tamaño aproximado de 0,3 µ m que, al contrario de lo que ocurre en todas las células nucleadas, presentaban ausencia de gránulos y muy pocas crestas en su interior (2-3 por mitocondria). Los gránulos * , presentes en todas las preparaciones en un número variable que osciló entre 5 y 30 por sección plaquetaria, presentaron una amplia diversidad de formas redondeadas, baciliformes y ovales, oscilando su tamaño entre 0,2 y 0,4 µ m. Un hecho característico de este tipo granular pudo evidenciarse claramente en nuestras preparaciones; su densidad electrónica a veces fue uniforme, pero en general pudieron observarse distintos grados de condensación. Este hallazgo es típico de los procedimientos que utilizan para la fijación el glutaraldehído y el ácido ósmico. Sin embargo, en las preparaciones fijadas con el procedimiento paraformaldehído y cloruro amónico, los gránulos * presentaron una mayor uniformidad en términos de su densidad electrónica. El tercer tipo de organelas que pudieron ser observadas fueron los cuerpos densos, también llamados gránulos de almacenamiento de nucleótidos y aminas. Estas organelas se caracterizan por presentar una intensa densidad electrónica, y bajo nuestras condiciones experimentales presentaron una gran variedad de formas y tamaños, pero siempre caracterizados por la presencia de una área excéntrica ocupada por una estructura electrodensa rodeada por un halo claro, lo que le proporcionaba un aspecto de vesícula (probablemente son pequeñas vacuolas) que contiene un gránulo denso. Las citadas estructuras reciben el nombre de cuerpos con apariencia de "ojo de buey". El número de cuerpos densos dependió del tampón utilizado para la fijación. Es bien conocido que todas las técnicas convencionales de fijación subestiman el número de cuerpos densos y que sólo las técnicas de MET directa permiten determinar un número más real de estas organelas. De tal forma, en los experimentos en los que se utilizó el tampón fosfato, se pudo observar un menor número de cuerpos densos (media de 0,1 por cada sección plaquetaria) comparado al observado con el tampón Tyrode (uno por cada sección plaquetaria). En conclusión, y dado que en nuestras condiciones experimentales las plaquetas en reposo presentaron una completa integridad de las regiones principales es decir, del área periférica y sistema de membranas, del área sol-gel o matriz citoplasmática y del área de organelas, podemos afirmar que el método desarrollado por nuestro laboratorio es apropiado para estudios morfológicos y ultraestructurales de las plaquetas humanas.
Plaquetas estimuladas por trombina
Los PRP fueron incubados a temperatura ambiente durante 5 min con trombina (0,01 U/ml y 0,1 U/ml). En presencia de bajas concentraciones del agonista (0,01 U/ml) las plaquetas sufrieron un rápido cambio de forma. El contorno superficial liso y las pequeñas interdigitaciones, que característicamente podían observarse al MER en las plaquetas en estado de reposo, cambió drásticamente, dando lugar a plaquetas con una morfológica esférica con profundas irregularidades a lo largo de toda la superficie de su membrana plasmática (fig. 3), y en determinadas secciones se pudo apreciar cómo algunas plaquetas presentaban un cierto grado de prolongación o formación citoplasmática, como si se tratara de un estadio morfológico transicional entre las formas de reposo y las de activación. Hay que subrayar un dato altamente significativo observado con nuestra metodología: cuando las pequeñas plaquetas de forma fusiforme (tamaño menor a 2,5 µ m) fueron incubadas en presencia de bajas concentraciones de trombina, éstas presentaron una mayor resistencia a sufrir cambios morfológicos y, por tanto, un mayor grado de resistencia a la activación. Por contra, las grandes plaquetas de forma discoidal y elipsoidal y de tamaño superior a 2,5 µ m rápidamente adoptaron las típicas formas esféricas con emisión de pequeños seudópodos, indicando claramente su transición al estado de activación. En la MET se pudo observar cómo la banda circunferencial de microtúbulos desapareció, mientras que en los seudópodos de nueva formación emergían microtúbulos simples o incluso parcialmente fragmentados (fig. 4). Un signo característico de la activación inducida por bajas concentraciones de trombina fue el vaciamiento granular parcial, apreciándose como un proceso de dilución progresiva del contenido granular. Característicamente, los cuerpos densos se vaciaron más pronto que los gránulos * . No obstante, previamente al vaciamiento granular, se observó un grado parcial de centralización granular y saculocanalicular en el que ambos elementos aparecieron encerrados en anillos muy ajustados formados por microtúbulos y microfilamentos, probablemente derivados del proceso de constricción del anillo microtubular que adoptó una posición central. Este proceso, que fue mucho más evidente a concentraciones de trombina de 0,1 U/ml (véase más adelante), a bajas concentraciones sólo se pudo observar en sus fases iniciales, es decir, sólo fueron evidentes la distribución centralizada pero sin constricción microtubular, la degranulación o dilución granular moderada con aclaramiento de la densidad electrónica de los gránulos * y la desaparición total de los cuerpos densos. Finalmente, las conexiones entre el SCA y el STD empezaron a hacerse evidentes, aunque fueron mucho más pronunciadas a altas concentraciones de trombina. Así pues, en presencia de altas concentraciones del agonista, la morfología plaquetaria sufrió profundos e intensos cambios. De tal manera que la morfología plaquetaria, que inicialmente era discoidal, fusiforme y elipsoidal, adoptó una multitud de formas esféricas y dendríticas, pero todas ellas caracterizadas por la emisión de pequeños seudópodos y largas estructuras filopódicas, lo que facilitaba enormemente el contacto entre las plaquetas (fig. 5). Cuando la concentración celular fue baja, las plaquetas aumentaron considerablemente de tamaño, emitiendo grandes seudópodos y largas formaciones filopódicas, observándose también formas gigantescas con emisión de grandes prolongaciones. Sin embargo, cuando el número de plaquetas era elevado, se pudo evidenciar una mayor tendencia a formar densos entramados formados por mallas de fibrina depositadas sobre las plaquetas distribuidas ordenadamente y en íntimo contacto a través de sus prolongaciones citoplasmáticas y las citadas fibras de fibrina. En la MET, el efecto de la trombina a altas concentraciones produjo profundas alteraciones ultraestructurales (fig. 6, paneles A y B) caracterizadas por una intensa vacuolización, pérdida de organelas, fusión saculocanalicular, fusión granular, migración sacular hacia la membrana periférica, marcadas conexiones entre el SCA y el STD, dilatación intensa del SCA, desorganización microtubular, centralización granular y emisión de seudópodos y filópodos. Muy probablemente, el exceso de superficie de membrana necesario para que tuviese lugar la emisión de seudópodos y la formación de estructuras filopódicas se obtuvo a partir del SCA, pues éste disminuyó muy significativamente y prácticamente desapareció el típico aspecto de "esponja" que inicialmente presentaban las plaquetas en estado de reposo.
Plaquetas estimuladas por las LDL nativas
El efecto de las LDL no modificadas (LDL nativas) sobre la morfología y ultraestructura plaquetaria fue investigado en plaquetas procedentes de individuos normolipémicos aisladas, según el protocolo previamente descrito, e incubadas durante 10 min a temperatura ambiente en presencia de 0,5 g de proteína de LDLn/l. Las alteraciones morfológicas evaluadas por MER permitieron observar cómo las LDL nativas causaron rápidamente moderados signos de activación plaquetaria, caracterizados por la transición de las formas discoidales, elipsoides y fusiformes a un estadio de uniformidad morfológica, distinguido por la pérdida del contorno liso y la adopción de formas redondeadas con emisión de pequeños seudópodos (fig. 7). No obstante, en ninguna preparación se llegaron a observar signos evidentes de agregación plaquetaria, es decir, que a pesar de poder observar un cierto grado de contacto plaqueta-plaqueta no se evidenció formación de estructuras filopódicas, entramados de fibrina o agregados plaquetarios que contuvieran un gran número de elementos celulares. Todo ello indica que el grado de participación de la reacción de liberación del contenido granular es moderado cuando las LDL nativas interaccionan con las plaquetas. Por otra parte, el estudio de las alteraciones ultraestructurales inducidas por estas partículas demostró la aparición de pocos pero significativos cambios (fig. 8), observándose signos evidentes de emisión de pequeños seudópodos, centralización granular, dilución granular, desorganización microtubular y fusión y migración sacular. Sin embargo, el grado de vacuolización así como el de la dilución granular fueron moderados, pues la integridad de la mayoría de los gránulos estuvo preservada, lo que indica la poca participación de la reacción de liberación tal y como se pudo observar en los estudios morfológicos con MER.
Plaquetas estimuladas por las LDL mínimamente modificadas
Los cambios morfológicos y ultraestructurales inducidos por las LDL mínimamente modificadas (0,1 g de proteína/l) fueron evaluados siguiendo un procedimiento similar al descrito para las LDL nativas. En la figura 9 se puede observar cómo, al contrario de lo que ocurrió con las LDL nativas, las partículas de LDL mínimamente modificadas causaron drásticos cambios en la morfología plaquetaria. Se pudo observar una intensa emisión de seudópodos pero con una discreta formación de filópodos. Por tanto, a partir de los estudios morfológicos cabe pensar que el grado de participación de la reacción de liberación del contenido granular fue mayor que el observado con las LDL nativas. En el plano ultraestructural, el MET permitió identificar cómo este tipo de lipopartículas ejercieron un potente efecto citotóxico acompañado de mínimos cambios en la estructura granular y saculocanalicular (fig. 10). Todas las preparaciones permitieron evidenciar un intenso efecto citotóxico con destrucción selectiva de la membrana plasmática plaquetaria, acompañado de importantes cambios estructurales, como migración sacular, aumento de la vascoalización, fusión granular o saculocanalicular. Por otra parte, la emisión de seudópodos fue evidente, lo que indica la existencia de una asociación simultánea entre el estadio inicial de activación y el efecto citotóxico.
Plaquetas estimuladas por las LDL oxidadas
La incubación de las plaquetas en presencia de 0,1 g/l de proteína de LDL modificada mediante oxidación (LDLox), permitió observar cómo este tipo de lipopartículas producía efectos similares, aunque en menor grado, a los descritos para la trombina a concentraciones elevadas. Los cambios morfológicos inducidos por las LDLox e identificados mediante MER fueron evidentes y significativos (fig. 11). Las plaquetas en presencia de este tipo de lipopartículas rápidamente cambiaron de forma adoptando la típica morfología de las plaquetas en estado de activación, es decir, emisión de seudópodos, contacto plaqueta-plaqueta, pérdida del contorno liso de la superficie plasmática y emisión de prolongaciones filopódicas. Sin embargo, no se evidenciaron los efectos propios de las dosis elevadas de trombina, como las densas redes plaquetarias, la transformación dendrítica y la aparición de estructuras celulares gigantescas. El conjunto de los resultados obtenidos en el presente estudio demuestra que las LDLox tienen un efecto activador más intenso que las LDL nativas, las LDL mínimamente modificadas y la trombina a bajas concentraciones, pero menor que el de la trombina a concentraciones elevadas. Los cambios ultraestructurales fueron, asimismo, de un grado intermedio (fig. 12), pudiéndose observar en algunas preparaciones una intensa vacuolización, centralización granular y emisión de seudópodos. Sin embargo, en muchas preparaciones también pudo observarse la existencia de contenido en gránulos y una pobre emisión de seudópodos. Finalmente, también las LDLox causaron moderados efectos citotóxicos sobre la membrana plasmática plaquetaria, aunque en ningún caso fueron tan evidentes y significativos como los causados por las LDL mínimamente modificadas.
Discusión
Actualmente, se sabe que el efecto estimulador atribuido a la hipercolesterolemia parece involucrar a dos mecanismos de acción que actuarían de forma complementaria11,14. El primer mecanismo, denominado receptor-independiente, está definido por cambios en la composición lipídica de las membranas plasmáticas de las plaquetas. Múltiples estudios han demostrado que las membranas plasmáticas de las plaquetas de individuos hipercolesterolémicos están enriquecidas en colesterol y fosfolípidos. Dado que las lipoproteínas plasmáticas no son capaces de transferir a las plaquetas el colesterol que transportan29, este enriquecimiento lipídico parece tener lugar durante la fase de formación de las plaquetas, es decir, en el megacariocito de la médula ósea30. En el segundo mecanismo, denominado receptor-dependiente, participa la interacción entre las partículas de LDL y unos receptores específicos presentes en la membrana plaquetaria, que parecen mediar la respuesta trombogénica inducida por las lipoproteínas plasmáticas18-21. Por tanto, se puede decir que la hipersensibilidad plaquetaria que clásicamente caracteriza a los individuos hipercolesterolémicos se debe, en primer lugar, a que sus plaquetas contienen una mayor cantidad de sustratos (ácido araquidónico y colesterol esterificado) necesarios para la formación de tromboxano y, en segundo lugar, que la transducción de la señal intraplaquetaria estaría aumentada por la interacción de las partículas lipoproteicas con sus receptores de la membrana de las plaquetas.
Sin embargo, aunque sabemos que las lipoproteinas son capaces de alterar el funcionalismo de las plaquetas, hasta la fecha no disponemos de estudios que investiguen en profundidad su efecto sobre la morfología y fisiología ultraestructural plaquetaria31. Como es bien conocido, si no se utilizan métodos apropiados para la obtención y manipulación de las suspensiones plaquetarias (tanto plasmas ricos en plaquetas como soluciones plaquetarias), su activación puede tener lugar rápidamente. La activación de las plaquetas debida a la manipulación de las suspensiones plaquetarias casi siempre suele ser reversible, pero con mucha frecuencia es causa de profundos cambios en la morfología y ultraestructura plaquetaria que, muy a menudo, se acompañan de formación de metabolitos del ácido araquidónico y de liberación del contenido granular. Por otra parte, la evaluación del grado de reactividad plaquetaria mediante la determinación de metabolitos del ácido araquidónico y/o de componentes granulares, o incluso la determinación de la agregabilidad mediante cambios en la transmitancia de la luz, son técnicas que, además de implicar un alto grado de manipulación de las muestras (y, por tanto, cabe pensar que pueden producir importantes grados de activación), presentan una gran variedad analítica32. Por otra parte, es bien conocido que todos los métodos actualmente empleados en la preparación de las suspensiones plaquetarias implican la utilización de técnicas separativas basadas en la centrifugación. Los plasmas ricos en plaquetas se obtienen a bajas velocidades (hasta 200 g), pero posteriormente en el procesamiento de las plaquetas se utilizan velocidades superiores (400-600 g). Indudablemente, estos procedimientos conllevan diferentes grados de pérdidas de las plaquetas de gran tamaño, así como niveles variables de activación plaquetaria32. Por todas estas razones, se puede asegurar que todas las aproximaciones empleadas hasta la fecha en el estudio de los cambios en la funcionalidad plaquetaria mediados por las lipoproteínas han presentado ciertos inconvenientes metodológicos31.
El objetivo del presente trabajo ha sido evaluar el efecto de las LDL tanto nativas como modificadas (mínimamente modificadas y oxidadas) sobre la fisiología ultraestructural plaquetaria. Para ello, se ha diseñado un nuevo método de aislamiento en el que las condiciones de reposo (no activación) fueron óptimas. A partir del PRP obtenido a baja centrifugación (200 g), con nuestro método las plaquetas fueron retenidas para su posterior fijación, deshidratación e inclusión mediante el uso de membranas no reactivas que contenían poros de un diámetro de 0,8 µ m, claramente inferior al diámetro medio plaquetario. Finalmente, los efectos mediados por los diferentes agentes estimuladores sobre la morfología y la ultraestructura fueron evaluados mediante métodos definitivos (microscopia electrónica de transmisión y de rastreo).
Bajo nuestras condiciones experimentales, las LDL nativas fueron capaces de causar leves pero significativos efectos activadores, apreciándose diferentes grados de emisión de pequeños seudópodos y cambios ultraestructurales. Sin embargo, el efecto de las partículas mínimamente modificadas fue mucho más evidente. En todas las preparaciones se pudieron observar importantes efectos citotóxicos sobre la membrana plasmática plaquetaria. La caracterización bioquímica de estas partículas demostró un importante enriquecimiento en hidroperóxidos. Es bien conocido que este tipo de sustancias reactivas son altamente citotóxicas28, lo que podría explicar el efecto observado en nuestras preparaciones. Finalmente, los cambios morfológicos y ultraestructurales mediados por las lipopartículas de LDL oxidadas fueron los más evidentes. En todas las preparaciones se pudieron evidenciar diferentes grados de emisión de seudópodos, así como significativos cambios en la fisiología ultraestructural plaquetaria. A partir de nuestros resultados, se puede concluir que las LDL tanto nativas como oxidadas son capaces de alterar la morfología y ultraestructura plaquetaria en diferentes grados que dependen del tipo de partícula, pero en ningún caso pueden ser consideradas, como la trombina, agonistas fuertes de la agregación plaquetaria. Postulamos que la lipoproteínas son capaces de alterar la sensibilidad plaquetaria actuando como agonistas débiles de la agregación. Sólo en condiciones patológicas, como es el caso de individuos hipercolesterolémicos con lesiones arterioscleróticas en las arterias coronarias, podrán aumentar la respuesta trombogénica de las placas ulceradas y, por consiguiente, contribuir a la aparición de síndromes coronarios agudos.
Agradecimiento
Este trabajo ha sido financiado parcialmente por la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (proyectos SAF94-0191 y SAF98-0081), por la Unión Europea, programa Biomed 2 (contrato BMHT-CL96-0134) y por la International Atherosclerosis Society (Beca Daria Haust 1996).