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Vol. 1. Núm. 2.
Páginas 64-67 (Abril - Junio 2008)
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Vol. 1. Núm. 2.
Páginas 64-67 (Abril - Junio 2008)
Nota técnica
DOI: 10.1016/j.labcli.2008.05.002
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Comparación de citocinas plasmáticas en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad con y sin diagnóstico previo de EPOC por una técnica multiplex
Comparison of plasma cytokines using a multiplex technique in patients with community acquired pneumonia with or without COPD
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J.F.. Jesús F. Bermejo-Martína,b,??
Autor para correspondencia
jbermejo@hcuv.sacyl.es

Autor de correspondencia.
, Julia Barbadoc, R.. Rocío González-Gallegoc, M. Cristina García-Loygorrib, Rubén Iglesiasa, Rosa M. Matec, Nuria Buenoc, Pilar Carrerasc, Antonio Jimenoc, Raúl Ortiz de Lejarazub, Eduardo Arranza
a Laboratorio de Inmunología de las Mucosas. IBGM. Universidad de Valladolid. Valladolid. España
b Servicio de Microbiología e Inmunología. Hospital Clínico Universitario. Valladolid. España
c Servicio de Medicina Interna. Hospital Clínico Universitario. Valladolid. España
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Figuras (1)
Resumen

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se asocia con una mayor mortalidad en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad (NAC). En este trabajo se comparan los valores plasmáticos de 9 citocinas en 10 pacientes ingresados en nuestro hospital por NAC diagnosticados previamente de EPOC y 10 pacientes también ingresados por NAC pero sin EPOC. Para ello se utilizó el equipo Th1/Th2 para detección múltiple de citocinas de Biorad sobre una plataforma Luminex. Al ingreso, los pacientes con EPOC mostraron unos valores significativamente menores de interleucina-2, GM-CSF e IFN-γ que los pacientes sin EPOC. Estos mediadores contribuyen en gran manera a la inmunidad adaptativa y a la activación de linfocitos T, por lo que su menor concentración en plasma sugiere la existencia de una respuesta inmune empeorada en los pacientes con EPOC que presentan una NAC. Esta respuesta empeorada podría contribuir a explicar el aumento de mortalidad en estos pacientes. Nuestros resultados muestran también la utilidad de las técnicas multiplex para la detección simultánea de varios mediadores en la misma muestra en estudios de investigación clínica.

Palabras clave:
Citocinas
Neumonía
EPOC
Respuesta empeorada
Abstract

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is associated with increased mortality in patients with community acquired pneumonia (CAP). In this work we have compared the plasma levels of 9 cytokines in 10 patients admitted to our hospital with CAP and a previous diagnosis of COPD against the levels of 10 patients with CAP and no COPD. For this we used the Biorad TM Th1/Th2 kit for multiple detection of cytokines on a Luminex platform. At admission, patients with COPD showed significantly lower levels of IL-2, GM-CSF and IFN-γ than patients with no COPD. These mediators are key contributors to adaptive immunity and to T cell activation. As a result, their concentration in plasma suggests an impaired immune response in those patients with COPD suffering from CAP. This impaired response could help to explain the increased mortality observed in these patients. Our results also show the usefulness of multiplex methods for simultaneous detection of several mediators in the same sample in clinical research studies.

Keywords:
Cytokines
Pneumonia
COPD
Impaired response
Texto completo
Introducción

Recientemente se ha descrito la asociación entre enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el incremento de la mortalidad en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad (NAC)1. Asimismo, hay evidencias cada vez mayores que han identificado respuestas inmunológicas empeoradas y un incremento en la susceptibilidad a las infecciones del tracto respiratorio inferior en pacientes con EPOC. Por ejemplo, los macrófagos alveolares de pacientes con EPOC presentan respuestas defectivas a antígenos de Haemophilus influenzae2. Los pacientes con EPOC muestran también una quimiotaxis empeorada de neutrófilos así como respuestas deficientes de inmunidad celular sistémica3,4. El objetivo de nuestro estudio fue comparar los valores plasmáticos de 9 citocinas en 10 pacientes con NAC y diagnóstico previo de EPOC frente a los valores de estas citocinas en 10 pacientes con NAC sin EPOC.

MétodosPacientes

El estudio se realizó entre el 1 de febrero y el 1 de abril de 2007 en el Servicio de Medicina Interna del Hospital Clínico Universitario de Valladolid. Se incluyeron en él los primeros 10 pacientes ingresados por NAC con diagnóstico previo de EPOC (grupo 1) y los primeros 10 pacientes ingresados con NAC pero sin diagnóstico de EPOC (grupo 2). El diagnósticó de neumonía adquirida en la comunidad se estableció cuando el paciente cumplía los siguientes criterios: aparición de un nuevo infiltrado en la radiografía de tórax más al menos 1 de los siguientes síntomas de infección del tracto respiratorio inferior: fiebre > 37,8°C, tos, esputo, disnea, dolor pleurítico, leucocitosis y confusión mental5. Los pacientes con EPOC habían sido previamente diagnosticados de esta enfermedad en el Servicio de Medicina Interna de nuestro hospital de acuerdo a la “iniciativa global para los criterios diagnósticos de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica”6. El estudio se realizó bajo los criterios éticos de la Declaración de Helsinki. En todos los casos se solicitó al paciente un consentimiento informado por escrito antes de su inclusión en el estudio. Además, se obtuvo la aprobación del comité de ética para la investigación clínica de nuestro hospital antes del comienzo del estudio.

Diagnóstico microbiológico

Se realizó la tinción de Gram a las muestras de esputo y de secreciones traqueales utilizando los medios habituales de cultivo (agar sangre, agar chocolate o agar McConkey). La identificación bacteriana se realizó por métodos estándar7.

Medición de citocinas

Al ingreso, se recogió una muestra de sangre en tubos EDTA-vacutainer. Los plasmas se obtuvieron tras centrifugación apropiada y fueron congelados a −70°C hasta que tuvo lugar la detección de las citocinas. Se midieron 9 citocinas en los plasmas utilizando un ensayo multiplex (Biorad, Hercules, CA, USA) sobre una plataforma Luminex (Austin, TX, USA). Los ensayos Bio-Plex para citocinas están basados en un formato de inmunoanálisis en sándwich. El anticuerpo específico de cada citocina es unido de forma covalente a esferas de polestireno codificadas por color. Las bolitas con el anticuerpo unido se mezclan en una placa de 96 pocillos fenestrada en el fondo con la muestra que contiene una cantidad desconocida de citocina y, alternativamente, con una solución estándar que contiene una cantidad conocida de citocina. Después de realizar una serie de lavados mediante el uso de una bomba de vacío con el fin de desechar la proteína no unida, se procede a la adición de un anticuerpo biotinilado específico de un epítopo diferente de la citocina. La mezcla de reacción se detecta mediante la adición de estreptavidina-ficoeritrina, la cual se une a los anticuerpos biotinilados. El contenido de cada pocillo se adquiere en una plataforma Luminex usando el software de Bio-Rad, el cual identifica y cuantifica cada reacción específica basada en el color de la bolita y la fluorescencia emitida. Las concentraciones desconocidas de citocinas se calculan por el software Bio-Plex Manager™, utilizando una curva estándar derivada de los estándares recombinantes que se sirven con el equipo. Los límites de detección (pg/ml) de la técnica para las 9 citocinas fueron los siguientes: interleucina (IL)-2 (1,5); IL-4 (0,32); IL-5 (3,48); IL-10 (3,28); IL12p70 (2,77); IL-13 (0,55); GM-CSF (0,55); interferón (IFN)-γ (13,02); factor de necrosis tumoral (TNF)α (3,8). A los valores por debajo del límite de detección se les asignó el límite de detección.

Estadística

El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 15.0 para Windows. Las diferencias en los valores de mediadores entre grupos se evaluaron utilizando el test de Mann-Whitney. Las asociaciones entre las concentraciones de citocinas y la saturación de oxígeno se estudiaron calculando el coeficiente de correlación de Spearman-Karber. El nivel de significación se fijó en p=0,05.

Resultados y discusión

No se encontraron diferencias significativas en edad entre los 2 grupos (media [desviación típica]) (grupo 1: 72,3 [10,3]; grupo 2: 63,5 [16,9]). Tampoco se encontraron diferencias significativas en la duración del período de hospitalización (grupo 1: 13,8 [5,6]; grupo 2: 10,7 [2,3]). Por el contrario, los pacientes del grupo 1 mostraron valores saturación de O2 al ingreso significativamente menores (fig. 1). Se encontró un patógeno causal en el 50% de los pacientes del grupo 1 (1 caso de Acinetobacter baumannii, 1 caso de S. pneumoniae, 1 caso de Staphylococcus aureus, 1 caso de Pseudomonas aeruginosa y, finalmente, 1 caso de coinfección por A. baumannii+P. aeruginosa). En el caso del grupo 2, solamente se identificó un patógeno causal en 1 paciente (1 caso de S. aureus). Los valores de IL-5, IL-10, IL-12p70 e IL-13 estuvieron por debajo del límite de detección para cada una de estas citocinas y, por tanto, estos mediadores fueron excluidos de las comparaciones entre el grupo 1 y el grupo 2. Los valores de IL-2, GM-CSF e IFN-γ fueron significativamente menores en los pacientes del grupo 1 (NAC con EPOC) que en los pacientes del grupo 2 (NAC sin EPOC). No se encontraron diferencias entre los 2 grupos en las concentraciones de IL-4 ni de TNFα. No se encontró correlación alguna entre los valores de las citocinas detectables y la saturación de O2 de los pacientes, saturación medida al ingreso por pulsioximetría convencional.

Figura 1.

Comparación de las concentraciones de citocinas en plasma (pg/ml) y de la saturación de O2 (%) en pacientes con neumonía adquirida en la comunidad (NAC) con enfermedad pulmonar obstrucitva crónica (EPOC) (grupo 1) y pacientes con NAC sin EPOC (grupo 2) al ingreso.

(0,16MB).

Los resultados de este estudio apuntan a la existencia de respuestas deficientes a la infección en los enfermos que presentan NAC y EPOC. EL GM-CSF es un corregulador clave de la intensidad y persistencia de la señalización inflamatoria8. El GM-CSF prima a neutrófilos y monocitos, e induce la secreción de citocinas y quimiocinas proinflamatorias. Además, GM-CSF juega un papel central en la interconexión entre la inmunidad innata y la adquirida. Al igual que GM-CSF, el IFN-γ es un contribuyente clave de la inmunidad adaptativa, especialmente de las respuestas T-helper 19. Finalmente, la IL-2 juega un papel muy importante en la activación de los linfocitos T. La IL-2 estimula el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de los linfocitos T-citotóxicos seleccionados por el antígeno10. En consecuencia, los valores relativamente menores de IL-2, GM-CSF e IFN-γ en pacientes con NAC y diagnóstico previo de EPOC respecto a los que no presentan EPOC, pudiera reflejar la existencia de problemas por parte de los primeros para desencadenar la respuesta inmune secundaria, la cual contribuye de forma decisiva a superar la infección, mediante el desarrollo de la respuesta inmune celular y de anticuerpos. Esta respuesta deficiente puede también contribuir a explicar el incremento de la mortalidad observada previamente en los pacientes con NAC y EPOC. El reducido tamaño muestral de este estudio impide llegar a conclusiones definitivas, pero los resultados obtenidos inciden en la necesidad de realizar estudios con mayor número de pacientes que incluyan una evaluación más amplia del estado de inmunidad en los pacientes con EPOC, los cuales podrían ayudar a diseñar estrategias preventivas frente a las infecciones respiratorias en estos enfermos.

Nuestro trabajo demuestra finalmente la utilidad de las técnicas multiplex de detección simultánea de citocinas en el desarrollo de estudios de investigación clínica.

Agradecimientos

Los autores agradecen al equipo de enfermería del Servicio de Medicina Interna del Hospital Clínico Universitario de Valladolid su cooperación en la recogida de muestras de este estudio, la cual realizaron de la forma más cómoda posible para los pacientes.

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Este trabajo ha sido posible gracias al Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) del Instituto de Salud Carlos III, el cual financia el contrato de Jesús F. Bermejo-Martín (EMER07/050).

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