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Vol. 51. Núm. 1.
Páginas 66-70 (Enero - Marzo 2019)
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Vol. 51. Núm. 1.
Páginas 66-70 (Enero - Marzo 2019)
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DOI: 10.1016/j.ram.2017.11.007
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Aislamiento de Aspergillus tritici desde ambiente interno (Chile): alcances ecológicos y clínicos
Isolation of Aspergillus tritici from internal environment (Chile): Ecological and clinical scope
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Peggy Vieille Oyarzo
Autor para correspondencia
peggy.vieille@uv.cl

Autor para correspondencia.
, Rodrigo Cruz Choappa, Eduardo Piontelli Laforet
Laboratorio de Micología, Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile
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Resumen

Los ambientes internos son un hábitat protector importante, donde el hombre reside o trabaja la mayor parte de su tiempo. Muchos de estos ambientes carecen de buena ventilación, lo que influye en la composición de sus comunidades microbianas y, en especial, de la fúngica. El objetivo de este estudio es comunicar la presencia de Aspergillus de la sección Candidi en ambientes internos de la Escuela de Medicina de la Universidad de Valparaíso, Chile, y destacar su rol ecológico y su importancia en micología médica. Se efectuó la clasificación morfofisiológica y molecular de dichos aislamientos. Se realizó un muestreo no volumétrico ambiental en agar papa glucosado (PDA) mediante la exposición de 2 placas en 10 diferentes ambientes internos para seleccionar las especies de Aspergillus. Se efectuaron subcultivos en agar Czapek con extracto de levadura (CYA), agar extracto de malta (MEA) y agar creatina sacarosa (CREA) solo para las especies de esporas blancas, para su identificación morfofisiológica y posteriormente molecular. De 20 muestras analizadas, en solo una se aisló un miembro de Aspergillus perteneciente a la sección Candidi. Sobre la base de sus características morfológicas y moleculares, se clasificó a este aislamiento como Aspergillustritici Mehrotra & Basu. Se describe su ecología y se discute su importancia médica.

Palabras clave:
Aspergillus tritici
Sección Candidi
Abstract

Indoor environments provide important protective habitats for humans, who live or work in them most of the time. Many of these environments lack ventilation, which affects the composition of microbial communities, especially that of the fungal community. The aim of this study is to report the isolation of Aspergillus section Candidi from indoor environments of the School of Medicine at Universidad de Valparaiso, Chile, and identification through morpho-physiological and molecular approaches. Their ecological and clinical features were highlighted. An environmental non-volumetric sampling was performed on PDA medium; 2 petri dishes were exposed in 10 different places to select the Aspergillus samples. Subcultures were performed on agar Czapek with yeast extract (CYA), malt extract agar (MEA) and creatin sacarose agar (CREA) media only for the morpho-physiological and later the molecular identification of white spore species. Of the 20 samples analyzed, one Aspergillus belonging to Candidi section was isolated. Based on its morphology and molecular features, it was classified as Aspergillustritici Mehrotra & Basu. Its ecology and medical relevance are reviewed and discussed.

Keywords:
Aspergillus tritici
Section Candidi
Texto completo

Los ambientes internos son un hábitat protector importante, donde el hombre reside o trabaja la mayor parte de su tiempo. Muchos de estos ambientes carecen de buena ventilación, lo que influye en la composición de sus comunidades microbianas y, en especial, de la fúngica, que se adapta con el tiempo a su temperatura, humedad y sustratos orgánicos diversos, como materiales de construcción, textiles, productos alimenticios, polvo, etc.12. Al crecer activamente en estos sustratos, los hongos dispersan una gran cantidad de propágulos (especialmente mitosporas) al aire, que pueden afectar a los humanos, ya sea por ser alérgenos, productores de micotoxinas, patógenos o patógenos oportunistas (en individuos con compromiso inmune), o bien por ser capaces de alterar los alimentos, así como de causar problemas en la agricultura y daños estructurales en los materiales edilicios3,4,12.

Los géneros Aspergillus, Penicillium y Talaromyces (Eurotiomycetes) son los hongos más comunes de ambientes internos12,15, a menudo asociados a sustratos específicos en los cuales producen gran cantidad de conidios, situación que facilita su aislamiento en diversos medios de cultivo.

Entre los representantes de género Aspergillus (que incluye más de 350 especies)13 comunes en ambientes internos, se aísla frecuentemente Aspergillusniger, Aspergilluscalidoustus, Aspergillusrestrictus, Aspergillussydowii, Aspergillusflavus y Aspergillusfumigatus, entre otros. Estos organismos son capaces de producir micotoxinas y diversas micosis humanas, en especial los dos últimos4,9.

La identificación morfológica de Aspergillus sigue principalmente los protocolos de Samson et al.13 y Houbraken et al.6. Las especies se agrupan en 4 subgéneros (Aspergillus, Circumdati, Fumigati y Nidulantes) y 20 secciones13. Aspergillus tritici es una especie perteneciente a la sección Candidi, que incluía una sola especie de esporas blancas: Aspergilluscandidus Link. Dicho organismo se distribuye en zonas subtropicales y tropicales y es comúnmente encontrado en granos almacenados, semillas, especias, nueces y productos deshidratados (carne y frutas). Es morfológicamente muy similar a A.niger, excepto por la ausencia de coloración y la rugosidad de sus conidios5. A.candidus actúa disminuyendo la germinabilidad del grano contaminado y produciendo componentes bioactivos con probable potencial tóxico8.

En la revisión de la sección Candidi de Varga et al.14, donde combinan datos de biología molecular, morfología, fisiología y perfiles de metabolitos secundarios, se establece que la sección comprende cuatro especies biseriadas de esporas blancas a amarillentas, moderadamente xerofílicas: Aspergilluscandidus, Aspergilluscampestris, Aspergillustaichungensis y A.tritici.

Todas estas especies producen terfenilinas y candidusinas. La mayoría de estos compuestos son exclusivos de esta sección, por lo que son considerados como indicadores quimiotaxonómicos. Estos compuestos exhiben propiedades antioxidantes, citotóxicas, antimicrobianas e inmunosupresoras2. Actualmente, la sección está compuesta por seis especies, dada la adición de Aspergilluspragensis y Aspergillussubalbidus15. La literatura reporta micosis, tanto superficiales como invasoras, atribuidas a A.candidus1,4,10; sin embargo, esta especie no es capaz de crecer a 37°C. Las únicas especies de la sección que poseen esta característica fisiológica son A.tritici y A.taichungensis, por lo que es probable que una de estas sea el agente causal de dichas infecciones, aunque también podrían estar provocadas por especies de esporas blancas mutantes de otras secciones, como A.flavus4.

Nuestro objetivo es comunicar el aislamiento de Aspergillus de la sección Candidi en ambientes internos de la Escuela de Medicina de la Universidad de Valparaíso, así como destacar su rol ecológico y su importancia en micología médica.

Se realizó un muestreo ambiental, no volumétrico, que consistió en la exposición de dos placas de 10cm de diámetro con agar papa dextrosa (PDA) expuestas al aire por 15min en 10 diferentes ambientes internos (4 aulas, 4 oficinas, un auditorio, un hall de acceso). Posteriormente, se incubaron a 25°C durante 10días. Mediante el uso de una lupa estereoscópica se seleccionaron los desarrollos de Aspergillus en las placas; solo en una de las placas se destacó la presencia de una colonia de esporas blancas. El aislado se subcultivó en tres puntos de inoculación en placas de agar extracto de malta (MEA), agar Czapek con extracto de levadura (CYA) y agar creatina sacarosa (CREA) a 25°C y a 37°C para evaluar el crecimiento y la posible producción de ácido. Se incubaron por espacio de 7días. Desde uno de los cultivos puros obtenido en MEA se obtuvo un inóculo para sembrar en matraz Erlenmeyer con caldo de malta al 2% para la obtención de micelio y posterior extracción de ADN. Pasados 10días de incubación en caldo, se filtró el micelio a través de papel de filtro y se lavó con solución fisiológica estéril tres veces, para retirar restos del medio de cultivo. Posteriormente y de manera aséptica, se traspasó a una placa Petri para el secado en estufa a 37°C hasta que visiblemente se deshidrató en su totalidad. Una vez obtenido el micelio seco, se trituró mecánicamente con un bisturí de punta roma hasta obtener 200mg de polvo de micelio, que se depositó en un tubo tipo Eppendorf de 1,5ml para seguir con el protocolo de extracción del kit GeneJET Plant Genomic DNA Purufication Mini Kit, Thermo Scientific, según instrucciones del fabricante.

Se amplificaron por PCR convencional los genes codificantes de la calmodulina (cebadores Cmd5 y Cmd6) y la β-tubulina (Btb2a y Btb2b) y regiones ITS (ITS1 y4) en termociclador T-100 de BioRad, con el siguiente protocolo por reacción: 12,5μl de DreamTaq M.Mix; 0,5μl de cada cebador [0,2μM]; 5μl de ADN para un volumen final de 25μl. Las condiciones fueron las siguientes: 95°C inicial por 3min y 35 ciclos de 95°C por 1min; 55,5°C por 30segundos y 72°C por 1min, y una extensión final de 10min. Para el paso de purificación se utilizó el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System Protocol (Promega) empleando el protocolo en gel. Los productos de la amplificación se secuenciaron con un equipo 3730 xl/DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific).

Los análisis morfológicos mostraron a los 7días de incubación colonias flocosas color crema, surcadas radialmente, con diámetros en MEA de 27mm (25°C) y 21mm (37°C), y en CYA de 32mm (25°C) y 27mm (37°C), con presencia de abundantes esclerocios color púrpura. Hubo poco crecimiento en CREA, sin producción de ácido. Se confirmó crecimiento hasta 40°C. En los análisis microscópicos se observaron conidióforos lisos de 150 a 790μm de largo por 5-9μm de ancho, con algunos septos; vesículas radiadas, redondas a ovoides, de 15 a 23μm de diámetro (variables en tamaño por presencia de cabezas diminutas), con métulas anchas de entre 9 y 17μm por 5-7μm y pequeñas fiálides de entre 3-4×2-3μm, dando origen a conidios esféricos, lisos a finamente rugosos, de 2,5 a 3,5μm de diámetro. Se observó gran variación en el tamaño de las estructuras conidiógenas. Sobre la base de estas características, se identificó morfológicamente a este hongo como A. tritici Mehrotra & Basu (fig. 1).

Figura 1.

A,B) MEA (anverso, reverso) 25°C. C,D)CYA 25°C. E,F)CREA (anverso) 25°C. En círculo, los puntos de crecimiento poco visibles. F)Detalle del escaso crecimiento a gran aumento. G)Conidióforo, métulas, fialides y conidios. H)Gran aumento de métulas y fialides. I)Esclerocios en CYA.

(0,35MB).

La identificación molecular de la especie se basó en la similitud de secuencias de regiones ITS del ADNr y de los genes de calmodulina y β-tubulina mediante la búsqueda en BLAST. Se comparó con las secuencias tipo depositadas en la base de datos GenBank. El aislamiento fue identificado como A.tritici con un 100% de identidad para β-tubulina y calmodulina, y con el 99% respecto del ITS de la cepa de referencia CBS 266.81. Se depositó en la base de secuencias con número de acceso a GenBank MG022438.1.

Los datos actuales indican que la sección Candidi incluye seis especies que comparten las siguientes características morfofisiológicas: crecimiento lento de sus colonias, con cabezas conidiales globosas, conidios hialinos o amarillos, conidióforos lisos, métulas que cubren entera la vesícula, con presencia de cabezas aspergilares con grandes métulas y, a la vez, cabezas diminutas, en todas las especies; conidios lisos a finamente equinulados, subglobosos a ovoides, y presencia de esclerocios en tres especies (A.candidus, A.taichungensis y A.tritici)11.

En un trabajo sobre polvo en ambiente interno en nueve países, Visagie et al15. reportaron la presencia de 1160 especies de Aspergillus, entre ellas algunas de la sección Candidi, pero no hallaron A.tritici. Esto sugiere que la presencia en estos ambientes no es muy común.

La ecología de A.tritici es evidentemente similar a la de A.candidus, cuya presencia se asocia a granos y alimentos almacenados, así como a alimentos fermentados14. Su presencia en el aire puede derivar también de diversos materiales vegetales presentes en el suelo, que dispersan sus conidios en el aire. Esta situación ya fue registrada en ambientes externos de Santiago de Chile.

Dentro de la micología médica, la presencia de especies de la sección Candidi en cuadros clínicos es poco frecuente; sin embargo, los reportes incluyen desde onicomicosis hasta aspergilosis invasoras4.

Es muy probable que algunos de los informes que refieren micosis causadas por el grupo de Aspergillus candidus Link obedezcan en verdad a A.tritici o a algún otro integrante de la sección Candidi, tal como se discute en Hubka et al.7. Después de revisar 178 cepas clínicas de Aspergillus recuperadas de pacientes de la República Checa, estos autores reportan el primer caso de A.tritici asociado a onicomicosis (sobre la base de estudios de secuenciación) y sugieren que podría tratarse del mismo agente asociado a A.candidus en reportes previos. En un estudio posterior del mismo grupo se estudiaron 9 cepas clínicas (seis de onicomicosis, una de otitis y dos de probables aspergilosis invasoras) que, sobre la base de la morfología, presumiblemente pertenecían a la sección Candidi. Los análisis por biología molecular (usando genes de β-tubulina, calmodulina y regiones ITS) mostraron que A.candidus fue el agente causal en la otitis, en tanto que de las dos muestras con probable aspergilosis invasora, una correspondió a Aspergilluscarneus (sección Terrei) y la otra a A.flavus (sección Flavi). Tres aislados recuperados de uñas fueron identificados como A.tritici y uno como A.candidus. En ese trabajo se propone, además, una especie nueva dentro de la sección: A.pragensis, aislado de uña de pie8.

Ribeiro et al.10 reportaron un caso clínico de aspergilosis invasora por A.candidus en un paciente inmunocompetente que trabajó durante más de 15años como agricultor, con constante exposición a molienda de granos. Dado que la clasificación de la especie la habían efectuado únicamente por morfofisiología, es probable que se tratara de algún otro miembro de la sección Candidi, ya que en ese mismo reporte se informa que hubo crecimiento a 37°C. Estos resultados demuestran la necesidad de utilizar la identificación polifásica de miembros de Aspergillus relacionados con casos clínicos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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