Introducción
La listeriosis es una infección asociada al consumo de alimentos contaminados por Listeria monocytogenes. Los rasgos clínicos de esta infección van desde un síndrome gripal leve hasta meningitis o meningoencefalitis. El microorganismo actúa como patógeno cuando las condiciones del huésped son favorables para su desarrollo (embarazadas, neonatos, ancianos e inmunodeprimidos), llegando a causar unas tasas de mortalidad del 20-30% 1.
Aunque la mayoría de los casos de listeriosis parecen ser esporádicos, en las últimas décadas se han identificado varios brotes epidémicos relacionados con el consumo de diversos alimentos 2. En general, es difícil diferenciar los brotes epidémicos de los casos esporádicos. Esto se debe principalmente a dos motivos: en primer lugar, el período de incubación de la listeriosis es largo, entre 7 y 60 días, lo que dificulta la identificación del alimento causante de la infección, y en segundo lugar, los casos que llegan a los centros sanitarios son aquellos que se dan en personas susceptibles de desarrollar cuadros graves, es decir, sólo vemos la punta del iceberg 3.
Con el fin de poder identificar brotes epidémicos se han desarrollado diversas técnicas fenotípicas y genotípicas para el subtipado de L. monocytogenes4,5. Entre las primeras, la serotipificación es la técnica clásica, aunque su poder de discriminación es bajo, ya que más del 90% de los aislados en humanos pertenecen a 3 de los 13 serotipos conocidos (1/2a, 1/2b y 4b) 6. Las técnicas genotípicas tienen un poder de discriminación más elevado y algunos autores propugnan que la electroforesis en campo pulsante (ECP) sea la técnica de referencia 6.
Durante el año 2003 hubo un incremento de casos de listeriosis diagnosticados en nuestro hospital. La razón de este incremento no estaba clara. Los objetivos de nuestro estudio fueron revisar las características clínicas de los casos diagnosticados en nuestra área de salud durante el período 2001-2003, y estudiar la relación clonal de los aislados clínicos de L. monocytogenes con el fin de identificar posibles brotes epidémicos.
Métodos
Pacientes y características del estudio
Se realizó un estudio retrospectivo de todos los pacientes diagnosticados de listeriosis en el Hospital 12 de Octubre de Madrid durante el período 2001-2003. Este hospital es el centro de referencia del Área de Salud N.º 11 de Madrid y atiende a una población aproximada de 550.000 habitantes. Las muestras clínicas fueron procesadas siguiendo los protocolos establecidos en nuestro laboratorio. La identificación bacteriana y la determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos se realizaron mediante el sistema Wider (Soria Melguizo, Madrid, España). Los aislados clínicos fueron conservados a 70 °C. La información demográfica y clínica fue recogida mediante revisión de las historias clínicas de los pacientes.
Serotipificación
La serotipificación de los aislados clínicos se realizó en el Centro Nacional de Microbiología (Majadahonda, Madrid, España) mediante aglutinación con antisueros, de acuerdo al método descrito por Seeliger y Höhne 6.
Electroforesis en campo pulsante
Se realizó según el método previamente descrito por Lukinmaa et al 3. Los aislados clínicos se recuperaron en placas de agar sangre, incubándose a 37 °C durante 18-24 h. Se tomó una colonia y se suspendió en medio líquido LB, incubándose a 37 °C en agitación durante 18 h. Los cultivos se centrifugaron a 3.000 rpm durante 15 min, se retiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 1 ml de buffer TE. De nuevo se centrifugó y el sedimento resultante se resuspendió con 200 ml de tampón PIV (10 mM Tris [pH 7,6], 1 M NaCl). Esta suspensión se mezcló a partes iguales con agarosa especial al 2% (Biorad, Richmond, USA). Los bloques se incubaron a 37 °C durante 5 h en un tampón de 6 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 100 mM EDTA suplementado con 10 mg/ml de lisozima y 5 mg/ml de ARNasas y de nuevo a 50 °C durante toda la noche en un tampón suplementado con 20 ng/ml de proteinasa K. Se realizaron 4 lavados de los bloques de 15 min cada uno con tampón TE 1x a temperatura ambiente. El ADN fue digerido a 37 °C durante 18-24 h de forma independiente con 25 U de AscI (New England Biolabs Inc., Beverly, Mass.) y 60 U de SmaI (New England Biolabs Inc., Beverly, Mass), respectivamente. La electroforesis se realizó en geles de agarosa al 1% en el sistema CHEF DRIII (Biorad, Richmond, USA). Las condiciones de electroforesis con AscI fueron de 22 h, pulsos de 4 a 40 s, temperatura de 14 °C, y voltaje 6 V/cm, y cuando se empleó SmaI fueron de 11,5 h, pulsos de 5 a 15 s en un primer bloque y de 15 a 40 s en un segundo bloque. Como marcador molecular se utilizó lambda ladder. El análisis de los patrones moleculares se realizó con el programa informático Bionumerics (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica). Se consideró que dos o más aislados de L. monocytogenes formaban parte del mismo clon si sus patrones moleculares eran indistinguibles mediante la técnica de ECP, tanto con la enzima AscI como con SmaI.
Resultados
Durante el período de estudio 18 pacientes fueron diagnosticados de listeriosis en nuestro hospital: 4 pacientes en el año 2001, dos en el 2002 y 12 pacientes en el año 2003. Las tasas estimadas fueron: 7,3 casos/1.000.000 habitantes para el año 2001, 3,6 para el año 2002, y 21,8/1.000.000 para el año 2003. Los pacientes se distribuían en 4 casos en neonatos y 14 en pacientes adultos. Las características demográficas y clínicas de los pacientes se presentan en la tabla 1.
Características de los pacientes
Todos los casos neonatales fueron considerados como sepsis de comienzo precoz (< 72 h). La edad gestacional media fue de 32 semanas (rango: 25 a 34 semanas), y el peso medio al nacer de 2.132 g (rango: 850-3.100 g). Tres de los casos neonatales tuvieron como antecedente clínico fiebre intraparto superior a 38 °C, pero en ninguno de los casos se dispuso de muestras clínicas de las madres para el aislamiento de L. monocytogenes. Ninguno de los casos neonatales falleció.
En todos los pacientes adultos el motivo de ingreso estuvo en relación con el aislamiento de L. monocytogenes y ningún caso se consideró como de adquisición intrahospitalaria. La edad media de los pacientes adultos fue de 59 años (rango: 35-78 años). Doce de los 14 (85,7%) pacientes adultos eran varones. Todos los pacientes tuvieron al menos un factor predisponente, siendo los más frecuentes: hepatopatía crónica (6 casos) y tumores sólidos malignos (4 casos). Uno de los pacientes de la serie tenía como factor predisponente, además de la hepatopatía crónica por virus de la hepatitis C (VHC), la coinfección por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuatro de los pacientes fallecieron en los 15 días posteriores al cuadro de listeriosis.
Tipificación de los aislados clínicos deL. monocytogenes
Se dispuso de 18 aislados clínicos de L. monocytogenes correspondientes a los 18 pacientes para estudios de tipificación. Doce casos pertenecían al serotipo 4b (66,7%), tres al serotipo 1/2a (16,7%), dos al serotipo 1/2b (11,1%) y uno al serotipo 1/2c (5,6%). Durante el período de estudio se observó que en el año 2003 correspondieron al serotipo 4b 10 de los 12 casos (83,3%). El análisis mediante electroforesis en campo pulsante, tanto con AscI como con SmaI, produjo 12 genotipos diferentes, si bien la interpretación de los resultados obtenidos con AscI fue más sencilla (fig. 1 y tabla 1). Un genotipo (patrón molecular G) fue compartido por 5 casos, dos genotipos (A y B) fueron compartidos por 2 casos cada uno, y nueve genotipos fueron considerados únicos. Todos los casos que compartían un idéntico patrón molecular tenían a su vez idéntico serotipo. De los 12 casos de listeriosis producidos en el año 2003, cinco presentaban el genotipo G, agrupándose entre los meses de enero a junio de ese año.
Figura 1. Dendograma con los patrones de electroforesis en campo pulsante (ECP) con la enzima AscI de los aislados clínicos de Listeria monocytogenes. La escala en la parte superior izquierda representa el porcentaje de similitud.
Discusión
En el presente trabajo es de destacar el aumento en la incidencia de listeriosis en el año 2003 (21,8/1.000.000) en nuestra área de salud, que se produjo a expensas de un clon de L. monocytogenes, responsable de 5 de los 12 casos de listeriosis. Este clon, con el patrón de ECP G, afectó a 5 pacientes durante el primer semestre de ese año. Un estudio de epidemiología molecular realizado en el estado de Nueva York durante los años 1996-2000, demostraba que el 31% de los casos de listeriosis en humanos declarados eran producidos por cepas con idéntico patrón molecular, y estos casos pudieran representar brotes producidos a partir de una misma fuente alimentaria 2. Probablemente, gran parte de los casos de listeriosis que llegan a nuestros hospitales no son los casos esporádicos que aparentan ser, sino que forman parte de brotes, con una única fuente alimentaria, que la mayor parte de las veces pasan inadvertidos. Las técnicas de epidemiología molecular son una herramienta muy útil para la detección y control de los brotes de origen alimentario, y deberían promover investigaciones complementarias sobre la naturaleza de los alimentos implicados. Aunque la incidencia de listeriosis documentada es baja, hay que tener en cuenta la variabilidad existente según la zona geográfica. Aun así, los sistemas de vigilancia están de acuerdo en que la verdadera incidencia de listeriosis está infravalorada 8.
La listeriosis era considerada clásicamente una infección que afecta sobre todo a mujeres embarazadas y neonatos 9, pero en los últimos años ha cobrado especial importancia en pacientes inmunodeprimidos y en pacientes con enfermedades crónicas. Nuestros hallazgos confirman esta tendencia, con sólo 4 casos de listeriosis diagnosticados en neonatos, frente a 14 en adultos. Los factores de riesgo que aparecen en nuestra serie ya han sido descritos anteriormente en la literatura médica como el alcoholismo, la insuficiencia renal crónica, la utilización de corticoides, el cáncer o la hepatopatía crónica 9-12. En contra de lo que cabría esperar, la incidencia de listeriosis en los pacientes infectados por el VIH-1 es baja, situación que también se refleja en nuestro país y que se ha explicado por diversas hipótesis, aunque ninguna de ellas es concluyente 13. En los neonatos la infección por L. monocytogenes es bien conocida, y la presencia de fiebre materna intraparto superior a 38 °C constituye un factor de riesgo para ésta y otras infecciones de transmisión vertical 14. No sorprende que la presentación clínica más habitual en nuestra serie sea la sepsis y la meningitis, al igual que en otras publicadas 9, sin embargo, merece especial atención el caso de peritonitis bacteriana espontánea que, si bien ya ha sido descrito previamente asociado a cirrosis 15, no es una presentación habitual.
Más del 90% de los aislamientos de L. monocytogenes en humanos pertenecen a los serotipos 1/2a, 1/2b y 4b; estos serotipos fueron también los aislados con mayor frecuencia en nuestros pacientes y además que en el año 2003 se produjo un incremento de casos, a expensas del serotipo 4b. Otros estudios realizados en España 16, señalan que el 81,7% de los aislados clínicos procedentes de humanos y animales pertenecen al serotipo 4b. Esta evolución de los serotipos contrasta con la publicada en otros trabajos 3,8, en los que se observa un descenso en la prevalencia del serotipo 4b a expensas de un incremento de los serotipos 1/2a y 1/2b. Tampoco se ha observado ninguna correlación entre genotipo y serotipo, aunque quizá nuestra serie no sea lo suficientemente amplia como para poner de manifiesto una correlación que otros autores sí han descrito 17,18.
La listeriosis es una infección transmitida por determinados alimentos, y el estudio de los serotipos de las cepas aisladas en alimentos y en humanos ha servido para identificar las vías de transmisión de la infección, y así poder controlar la cadena alimentaria. Estudios como el de De Simón et al 19 muestran una mayor prevalencia del serotipo 4b en las cepas que se aíslan de los alimentos, lo cual explicaría a su vez la elevada prevalencia de dicho serotipo en humanos.
La listeriosis es un problema de salud pública y por ello se realizan controles de L. monocytogenes en la industria alimentaria. Sin embargo, en España no se considera una enfermedad de declaración obligatoria, lo que dificulta la vigilancia de posibles brotes epidémicos. Dada la elevada morbilidad y mortalidad de esta infección, sería recomendable plantearse realizar los estudios epidemiológicos necesarios para detectar y erradicar estos brotes.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Julio Vázquez del Centro Nacional de Microbiología por la serotipificación de los aislados clínicos de L. monocytogenes, y al Dr. Fernando Dronda por sus comentarios y sugerencias.
Correspondencia: Dr. F. Chaves.
Servicio de Microbiología. Hospital 12 de Octubre.
Avda. de Córdoba, s/n. 28041 Madrid. España.
Correo electrónico: fchaves.hdoc@salud.madrid.org
Manuscrito recibido el 18-3-2005; aceptado el 7-6-2005.
