Objectives. We evaluated the antioxidant effects of the specific phenolic compounds of virgin olive oil and their ability to modify the release of eicosanoids, pro-inflammatory mediators, in leukocytes.
Results. All four phenolics inhibited leukotriene B4 generation at the 5-lipoxygenase level with effectiveness hydroxytyrosol > oleuropein > caffeic acid > tyrosol (approximate IC50 values: 15 µM, 80 µM, 200 µM and 500 µM, respectively). In contrast, none of these compounds caused substantial inhibition of thromboxane generation via the cyclo-oxygenase pathway. None of these compounds were toxic to leukocytes at the concentrations tested. Regarding the antioxidant and oxygen free radical scavenging properties, hydroxytyrosol, caffeic acid, oleuropein and tyrosol (decreasing order of effectiveness) quenched the chemiluminescence signal due to reactive oxygen species generated by tetradecanoylphorbolacetate-stimulated rat leukocytes, resulting in a 70% to 37% inhibition at 320 µM. In a cell free system the phenolics exerted potent scavenging effects of hydrogen peroxide and superoxide anion. Moreover, they prevented Fe3+-ascorbate-induced lipid peroxidation in a dose-related manner. The phenolics also scavenged nitrogen free radicals, as nitric oxide and peroxynitrite. Tyrosol, with only one hydroxyl moiety, was the less effective compound in the different assays.
Conclusions. We demonstrate that phenolics found in virgin olive oil possess an interesting array of lipoxygenase-inhibitory and antioxidant properties that might be related to the beneficial heath effects described for usual virgin olive oil consumers.
Introducción
La manipulación de la dieta es una estrategia importante en la prevención de las enfermedades cardiovasculares. En este sentido, está bien establecido que una dieta pobre en productos animales y alta en aceite de oliva se asocia con valores bajos de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (cLDL) y altos en colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (cHDL). Los efectos beneficiosos de la dieta mediterránea sobre el sistema cardiovascular han sido atribuidos, hasta ahora, mayoritariamente a su exclusivo perfil lipídico, pero debemos considerar también la aportación de antioxidantes naturales. La presencia de componentes minoritarios en el aceite de oliva podría explicar parcialmente los efectos beneficiosos de la dieta mediterránea, ya que éstos no se observan con otros tipos de dietas con una ingesta de ácido oleico similar a la proporcionada por el aceite de oliva1,2. A este respecto, la elección de aceite de oliva virgen extra, con un contenido en polifenoles más alto, proporciona un mayor consumo de anti oxidantes, aproximadamente 15-20 mg/día3, a los cuales se les atribuyen potentes actividades biológicas. Entre los polifenoles más característicos se incluyen derivados del ácido cinámico, como el ácido cafeico, el secoiridoide glucosilado: oleuropeína y los derivados resultantes de su hidrólisis, los fenoles: tirosol e hidroxitirosol (fig. 1).
En general, los radicales libres producidos en exceso y de una manera no controlada en los sistemas biológicos están implicados en el desarrollo de diversas enfermedades como la aterosclerosis, el cáncer, la lesión por isquemia-reperfusión e incluso en los procesos de envejecimiento4-8. El hecho de que el estrés oxidativo tenga un papel importante en el desarrollo de estas enfermedades ha estimulado la investigación en el campo de los antioxidantes naturales, especialmente de aquellos aportados por la dieta. Los radicales libres pueden atacar los dobles enlaces de los ácidos grasos poliinsaturados, originando peróxidos lipídicos. La susceptibilidad de los lípidos de las LDL al estrés oxidativo depende del adecuado balance entre su contenido en ácidos grasos poliinsaturados y determinados antioxidantes. Por otra parte, se conoce el gran potencial aterógeno de las LDL oxidadas por su papel en la formación de células espumosas. Una de las formas que tienen los sistemas biológicos para protegerse de las lesiones oxidativas son los antioxidantes naturales, que pueden actuar intra y extracelularmente. Varios estudios demuestran las propiedades antioxidantes específicas de los componentes fenólicos del aceite de oliva virgen frente a la oxidación de las LDL en modelos ex vivo9,10. Importantes contribuciones en esta área son las aportadas por Visioli et al3,11, que igualmente comprobaron que los fenoles del aceite de oliva virgen inhiben la oxidación de las LDL en sistemas in vitro.
Estudios realizados en humanos y en animales demuestran que los leucocitos polimorfonucleares están involucrados en el desarrollo de la enfermedad coronaria y otras complicaciones de la aterosclerosis4,12,13. Las interacciones de las plaquetas y los leucocitos con los componentes de la pared arterial, células endoteliales y células musculares lisas tienen un importante papel en el desarrollo de la arteriosclerosis y la iniciación de la trombosis14. Estas interacciones celulares, mediadas por moléculas de adhesión, están parcialmente reguladas por la formación de lípidos farmacológicamente activos, como eicosanoides (prostanoides y leucotrienos), factor activador de plaquetas y compuestos relacionados. Los leucotrienos favorecen la adhesión de leucocitos polimorfonucleares a la monocapa de células endoteliales, alterando el estado de activación de estas células y también de las plaquetas, contribuyendo a la inflamación y al daño vascular15,16. En experimentos realizados in vitro e in vivo se ha observado que las LDL oxidadas indujeron una inmediata adhesión de todo tipo de leucocitos al endotelio vascular, comprobándose el importante papel mediador de los leucotrienos en esta interacción leucocito/endotelio mediada por las LDL oxidadas17.
El leucotrieno B4, de gran poder quimiotáctico, favorece la acumulación de estas células en el lugar de la inflamación y es generado a partir del ácido araquidónico por la acción de la enzima 5-lipooxigenasa. Se conoce que esta enzima es inhibida por compuestos fenólicos frecuentemente encontrados en la dieta, como flavonoides y cumarinas18 y otros recientemente encontrados en el vino19. Por otra parte, el endotelio de los vasos modula el tono vascular produciendo sustancias vasodilatadoras y vasoconstrictoras. De ellas, las mejor caracterizadas son el óxido nítrico (ON*) y el anión superóxido (O2_). Estas moléculas, con efectos opuestos en el tono vascular, reaccionan una con la otra, anulando sus efectos individuales y produciendo sustancias altamente tóxicas como el radical peroxinitrito (ONOO_)20. En estados de hipercolesterolemia y aterosclerosis, el efecto vasodilatador del óxido nítrico liberado por el endotelio se encuentra alterado. Experimentos recientes demuestran que este fenómeno puede ser debido a un aumento en la degradación de óxido nítrico, derivado del aumento de anión superóxido que se produce tanto en las células endoteliales como las fagocíticas21. El per oxinitrito generado y las grandes cantidades de especies reactivas derivadas del oxígeno producidas por las células fagocíticas, macrófagos y leucocitos, pueden causar peroxidación lipídica en las lipoproteínas, induciendo daño tisular y contribuyendo a la patogenia de la arteriosclerosis22,23.
Dado el importante papel que los antioxidantes naturales pueden ejercer sobre estos procesos, en este estudio, planteamos como objetivo principal evaluar el efecto antioxidante de los compuestos fenólicos del aceite de oliva virgen, evaluando el poder captador de radicales libres derivados del oxígeno y del nitrógeno, así como la capacidad que tienen estos compuestos para modular la formación de eicosanoides proinflamatorios.
Material y métodos
Obtención de los compuestos
Los compuestos ácido cafeico y tirosol fueron suministrados por Fluka (Buchs, Suiza). La oleuropeína fue extraída de las hojas de Olea europea (Instituto de la Grasa CSIC, Sevilla). El hidroxitirosol se preparó por hidrólisis ácida de la oleuropeína24. Todos los compuestos fueron disueltos en dimetilsulfóxido (DMSO) y ensayados a diferentes concentraciones en los distintos experimentos con el objeto de calcular por recta de regresión los valores de las concentraciones inhibitorias medias (CI50).
Obtención de los leucocitos peritoneales de rata
Los leucocitos (un 85% polimorfonucleares y un 15% mononucleares) se obtuvieron a partir de ratas Wistar, tras inyección intraperitoneal de glucógeno al 6% y posterior lavado de la cavidad peritoneal con tampón Hank's25. Las células se ajustaron a una concentración de 2,5 106 células/ml en tampón Hank's conteniendo 1,26 mM de Ca2+ y 0,9 µM de Mg2+. La viabilidad celular se observó con el test de exclusión del azul tripán (0,05%), siendo superior al 95%.
Liberación de eicosanoides y medida por radioinmunoensayo
Alícuotas de 0,5 ml de leucocitos, tomadas por triplicado, fueron preincubadas a 37 °C durante 10 min con 2 µ l de los compuestos que se iban a ensayar disueltos en DMSO o un volumen equivalente del vehículo. Después se añadieron 5 µ l de ionóforo de calcio A23187 en DMSO para dar una concentración final de 1 µ M y se dejó otros 10 min de incubación. Al grupo control no se le añadió el estimulante. Las células se centrifugaron a 2.500 rpm durante 10 min a 4 °C, y los sobrenadantes fueron decantados y congelados a 20 °C por un tiempo no superior a 3 meses. Alícuotas (5-15 µ l) de las muestras descongeladas fueron sometidas a radioinmunoensayo para medir las concentraciones del tromboxano B2 (TXB2) y el leucotrieno B4 (LTB4) llevándolas hasta 100 µ l con tampón fosfato 50 µM (pH 7,5) que contenía un 0,1% de albúmina humana y un 0,9% de ClNa, añadiendo 200 µ l del antieicosanoide policlonal de conejo (ICI/Seneca) diluido 1:1.500 en el tampón, 100 µ l del eicosanoide marcado radiactivamente (10 nCi de 3H8-TXB2 o 4 nCi de 3H8-LTB4, respectivamente, Amersham) y mezclando e incubando a 4 °C durante 18 h. La fracción de ligandos marcada fue separada de la libre usando 200 µ l de una solución de carbón activo-dextrano preparada en el tampón. Centrifugados los tubos, se leyó la radiactividad (dpm) en un contador de centelleo Packard modelo 1900 TR25.
Ensayo de citotoxicidad
La respiración celular es un indicador de la viabilidad celular y en consecuencia de la posible citotoxicidad. Las células se incubaron en presencia de los compuestos fenólicos junto al reactivo bromuro de azul de tiazol (MTT) (Sigma, M-2128), un marcador de la fosforilación oxidativa mitocondrial, que se detecta a 550 nm cuando se reduce a formazán, habiéndose seguido el método descrito por Hattory et al26.
Generación de quimioluminiscencia a partir de leucocitos activados
Los leucocitos peritoneales de ratas se obtuvieron como en el ensayo anterior y el radical superóxido fue medido después de la estimulación de estas células con acetato de tetradecanoilforbol (TPA) añadido para dar una concentración final de 5 µ M siguiendo el método descrito por Saniabadi y Nakano27. Para ello, 1,5 ml de la suspensión de leucocitos en tubos de 5 ml fue preincubada 1 min con 50 µ l de lucigenin (250 µ M) a 37 °C y colocada en la cavidad de luz del luminómetro (LKB, Wallac 1250). La estimulación de las células se inició por la adición al tubo de la solución de TPA. La intensidad de la quimioluminiscencia fue monitorizada por lectura digital durante 5 min. Los resultados se calcularon como el área bajo la curva obtenida (mV).
Captación del radical superóxido y de peróxido de hidrógeno en sistema libre de células
El anión superóxido fue generado enzimáticamente por el sistema hipoxantina/xantina oxidasa y detectado por quimioluminiscencia como en el apartado anterior28. La actividad captadora de peróxido de hidrógeno fue ensayada usando la reacción del guaiacol: a 10 ml de la solución stock de los compuestos dispuestos por triplicado se le añadió una solución 0,1 µM de H2O2, después de incubar la mezcla 30 min a temperatura ambiente, se añadieron 50 µ l de una solución de guaiacol (al 0,2% en H2O destilada) y 10 µ l de la enzima peroxidasa de rábano (Sigma, P-8250) diluida 1 mg en 200 µ l, dejándose incubar 10 min más. Se procedió a la lectura de absorbancia a 450 nm en un lector de placas.
Medida de la peroxidación lipídica no enzimática
Los liposomas fueron preparados de fosfolípidos de cerebro bovino (Sigma, B3635) sonicados en baño de hielo (0-4 °C). Los tubos preparados por triplicado contenían diferentes concentraciones de los compuestos a ensayar, 0,2 ml de la suspensión de liposomas, 0,5 ml de tampón fosfato pH 7,4 y 0,1 ml de ácido ascórbico y 0,1 ml de FeCl3 añadidos en último lugar para inducir la peroxidación. Después de incubarlos a 37 °C, durante 60 min se determinó el grado de peroxidación por el método del ácido tiobarbitúrico (TBA test)29.
Actividad captadora de óxido nítrico
Para generar ON* utilizamos nitroprusiato sódico (Sigma, S-0501) en una solución acuosa a pH fisiológico, y lo detectamos por el reactivo de Griess, después de reaccionar con el O2 disuelto, ocasionando nitrito (NO2_). Los captadores de ON* compiten con el oxígeno, produciendo menor cantidad de nitrito30.
Actividad captadora de peroxinitrito
La proteína * 1-antiproteinasa ( * 1-AP) es la principal inhibidora de proteasas (como elastasa) en los fluidos humanos y es altamente sensible a la inactivación por ONOO_. La adición de ONOO_ a * 1-AP reduce la capacidad de esta enzima para inhibir la elastasa. Los captadores del radical peroxinitrito restablecen esta capacidad. El ensayo se realizó según han descrito Whiteman y Halliwell31. La síntesis del radical peroxinitrito se llevó a cabo como han descrito Beckman et al32.
Resultados
Efectos en la liberación de eicosanoides a partir de leucocitos de rata estimulados
Los cuatro compuestos fenólicos ensayados a las dosis de 40-200 µ M inhibieron la producción del leucotrieno B4 con la siguiente efectividad:: hidroxitirosol > oleuropeína > ácido cafeico > tirosol (inhibición del 100-35% a 200 µ M, CI50 aproximadas: 15, 80, 200 y 500 µ M, respectivamente) (tabla 1). Los compuestos de referencias no indicados en la tabla, ZM11965 y quercetina, redujeron la concentración del LTB4 entre un 98 y un 100% a 20 µ M. Por contra, ninguno de los fenoles modificaron la producción del TXB2 a esta dosis (tabla 1); en este caso los controles positivos, indometacina, piroxican y dazoxiben, inhibieron entre un 94 y un 100% cuando se ensayaron a 20 µ M. Estos resultados indican que los compuestos fenólicos producen un grado variable de inhibición de la generación del leucotrieno B4 a partir de leucocitos activados y que, por tanto, deben actuar en la enzima 5-lipooxigenasa antes que en la fosfolipasa A2, lo que produciría también una reducción de la concentración de TXB2. Ninguno de los compuestos alteró la integridad celular a las dosis ensayadas (tabla 1). Esto fue comprobado incubando la suspensión celular durante 30 min con los compuestos fenólicos y azul de tiazolio.
Efecto sobre la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS)
En relación con la actividad captadora de radicales libres, mostramos que los cuatro fenoles del aceite de oliva son capaces de reducir la generación de ROS a partir de leucocitos intactos, sin evidencia de producir toxicidad para los mismos. En la columna 2 de la tabla 2 se muestra que los fenoles hidroxitirosol, ácido cafeico, oleuropeína y tirosol redujeron la señal de luminiscencia en un porcentaje del 70, el 69, el 55 y el 37%, respectivamente. Nuestros resultados sobre la habilidad de estos compuestos para captar quimioluminiscencia debida a la generación de superóxido en células estimuladas con TPA, así como en el sistema hipoxantina/xantina oxidasa, y para captar peróxido de hidrógeno (columnas 3 y 4 de la tabla 2) sugieren que, entre ellos, el hidroxitirosol es el polifenol más activo, el ácido cafeico y la oleuropeína presentan una actividad intermedia y el tirosol es el compuesto menos eficaz como captador de estas especies derivadas del oxígeno.
Efecto sobre la peroxidación lipídica no enzimática
Los liposomas de cerebro bovino sufren una rápida peroxidación cuando son incubados en presencia de Fe3+ y ácido ascórbico. La oleuropeína y el hidroxitirosol evitaron la lipoperoxidación de forma dependiente de la dosis (fig. 2) dando CI50 de 11,5 y 14,5 µ M, respectivamente, comparadas con la CI50 de 1,5 µ M calculada para el flavonoide utilizado como referencia, quercetina. El ácido cafeico fue menos efectivo (CI50 > 200 µ M) y el tirosol no mostró inhibición ni a una dosis de 500 µ M. En experimentos controles se mostró que los compuestos fenólicos a las concentraciones ensayadas no interfirieron con la coloración desarrollada en el ensayo del ácido tiobarbitúrico.
Efecto sobre la captación de radicales derivados del nitrógeno
El compuesto tirosol no mostró actividad captadora de óxido nítrico. Por el contrario, los otros tres polifenoles tuvieron una acción captadora dependiente de la dosis (fig. 3), siendo el ácido cafeico el más efectivo (CI50: 58 µM ). Los efectos de la oleuropeína y el hidroxitirosol fueron semejantes a los del patrón de referencia curcumina con CI50 de 75 y 77 µM , respectivamente. En experimentos controles previos se comprobó que ninguno de los fenoles captaba directamente el anión nitrito.
Como era de esperar, la adición del radical per oxinitrito a la enzima * 1-antiproteinasa hizo disminuir su capacidad para inhibir la elastasa31. Una concentración de 0,5 µM de peroxinitrito fue seleccionada para producir una inhibición sustancial pero no completa de la actividad elastásica. Se realizaron experimentos controles donde se comprobó que ninguno de los fenoles tenía efecto directo sobre la elastasa o la * 1-antiproteinasa. En la figura 4 se muestra que a las concentraciones finales de 0,5 y 1 µM los fenoles incubados con la * 1-antiproteinasa y el ONOO_ produjeron un efecto protector frente a la inactivación de la * 1-antiproteinasa, detectado por la restitución de la actividad de la enzima elastasa. A estas dosis, los fenoles del aceite de oliva virgen, excepto el tirosol que se mostró algo menos potente, fueron tan efectivos captadores del radical peroxinitrito como el ácido ascórbico, poderoso antioxidante utilizado como patrón de referencia.
Discusión
La novedad del estudio presentado en este trabajo es que amplía el perfil de las propiedades de los fenoles del aceite de oliva virgen, mostrándonos una actividad inhibitoria selectiva sobre la vía 5-lipooxigenasa del metabolismo del ácido araquidónico, ya que producen una disminución de la producción de leucotrienos, sin afectar, sin embargo, la concentración de metabolitos derivados de la vía de la ciclooxigenasa. Este efecto ha sido demostrado para otros fenoles derivados de plantas como los flavonoides y cumarinas capaces de inhibir también la 5-lipooxigenasa leucocitaria, siendo este efecto más marcado en aquellos compuestos de tipo catecoles o que poseen dos grupos hidroxilos en posiciones vecinas en su estructura18,33. En el mecanismo de acción podría intervernir tanto la capacidad de estos compuestos para interceptar la producción de radicales peroxilos derivados del ácido araquidónico34, como su habilidad para unirse a los iones Fe3+ y reducirlos a la forma inactiva Fe2+, comportamiento semejante al ya descrito para otros compuestos polifenólicos35,36.
En relación con su acción captadora de radicales libres, en el presente estudio demostramos que estos compuestos son capaces de evitar la generación de radicales libres del oxígeno a partir de leucocitos activados y sin evidencias de toxicidad para éstos. De la medida de la capacidad de estos fenoles para reducir la luminiscencia debido al supe róxido en células estimuladas por tetradecanoilforbol, así como en el sistema hipoxantina/xantina oxidasa y para captar peróxido de hidrógeno (tabla 2) se deduce que de los cuatro fenoles, el hidroxitirosol es el más activo, el tirosol el menos potente, y que el ácido cafeico y la oleuropeína presentan una actividad intermedia, aunque más próxima a la del compuesto más activo hidroxitirosol. Por otra parte, la potente capacidad antioxidante de estos compuestos se ha visto ratificada por su acción en la prevención de la peroxidación lipídica de liposomas en presencia de Fe3+ y ácido ascórbico. El ti rosol con un solo grupo hidroxilo en el anillo aromático no mostró inhibición alguna sobre la peroxidación lipídica en este sistema no enzimático. Estos resultados son semejantes a los obtenidos por otros autores, que describieron este mismo efecto para estos compuestos en cultivos de hepatocitos suplementados con hierro como agente oxidante37. No cabe duda de que las propiedades antioxidantes demostradas en este estudio por los polifenoles del aceite de oliva virgen concuerdan con las propiedades mostradas por otros autores sobre la protección de las LDL frente a la oxidación in vitro11. Por otra parte, en este trabajo se muestra la eficacia de estos fenoles naturales en la prevención del daño oxidativo ocasionado por especies reactivas derivadas del nitrógeno. Así, excepto el tirosol, los fenoles ensayados fueron capaces de captar el ON. directamente, lo que fue medido por la reducción en la cantidad de nitrito generado a partir de nitroprusiato sódico. Igualmente la actividad captadora de peroxinitrito realizada por el ensayo de la inactivación de la enzima * 1-antiproteinasa indicaron que los cuatro fenoles fueron capaces de captar este radical porque protegieron esta enzima de ser inactivada por este radical.
Aun cuando no se conoce la cantidad de polifenoles en sangre aportados por una ingesta enriquecida con aceite de oliva virgen, cálculos estimativos realizados sobre la dieta mediterránea indican, que la ingesta de estos aceites proporciona entre 15 y 20 mg de fenoles al día. Estos datos podrían ser comparados con los de otros estudios que han demostrado cómo concentraciones similares de antioxidantes consumidas en la dieta durante períodos prolongados de tiempo reflejan una menor incidencia de muertes por enfermedad cardiovascular38.
En resumen, los resultados de este estudio indican que los principales fenoles presentes en el aceite de oliva virgen poseen un importante conjunto de propiedades antioxidantes e inhibidoras de la enzima lipooxigenasa leucocitaria. Los resultados sugieren que estos compuestos pueden actuar reduciendo la migración de leucocitos a la zona inflamada, reduciendo la producción de leucotrieno B4, poderoso agente quimiotáctico, y los consiguientes daños originados por la liberación de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno procedentes de células fagocíticas. Sin embargo, estos compuestos mantienen intacta la generación de prostanoides tipo tromboxanos originados por la vía de la ciclooxigenasa. Por extensión, se entiende que estos compuestos no producen inhibición en la generación de prostaglandinas, mediadores lipídicos derivados de esta misma vía enzimática, que actúan facilitando el flujo sanguíneo microvascular y realizando funciones inmunomoduladoras. Por todo ello podemos concluir que los polifenoles del aceite de oliva virgen podrían colaborar como agentes protectores contra aquellas alteraciones del sistema cardiovascular, cuya progresión se ve acelerada por la acumulación y adhesión de células leucocitarias a la zona inflamada.