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Vol. 93. Núm. 5.
Páginas 211-219 (Mayo 2018)
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Vol. 93. Núm. 5.
Páginas 211-219 (Mayo 2018)
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Identificación de nuevos genes candidatos para la retinopatía en diabéticos tipo 2. Estudio Valencia sobre Retinopatía Diabética (EVRD). Informe n.° 3
Identification of new candidate genes for retinopathy in type 2 diabetics. Valencia Study on Diabetic Retinopathy (VSDR). Report number 3
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M.D. Pinazo-Durána,b,g,1,
Autor para correspondencia
dolores.pinazo@uv.es

Autor para correspondencia.
, K. Shoaie-Niaa,g,1, S.M. Sanz-Gonzáleza,b,g, J. Raga-Cerveraa,g, J.J. García-Medinaa,b,c,g, M.I. López-Gálvezb,d,g, D. Galarreta-Mirab,d,g, L. Duartee,g, C. Campos-Borgesa,f,g, V. Zanón-Morenoa,b,g, por el grupo del Estudio Valencia sobre Retinopatía Diabética (EVRD)
a Unidad de Investigación Oftalmológica «Santiago Grisolía»/FISABIO y Unidad de Oftalmobiología Celular y Molecular, Departamento de Cirugía, Universidad de Valencia, Valencia, España
b Red Temática de Investigación Cooperativa de Patología ocular OFTARED, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España
c Departamento de Oftalmología, Hospital Universitario Morales Meseguer, y Departamento de Oftalmología, Universidad de Murcia, Murcia, España
d Departamento de Oftalmología, Hospital Clínico Universitario, Valladolid, España
e Departamento de Oftalmología, Hospital Entre Douro e Vouga, Porto, Portugal
f Departamento de Oftalmología, Hospital Privado da Boa Nova, Porto, Portugal
g Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Universidad de Valencia, Valencia, España
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Tabla 1. Criterios de inclusión/exclusión en el estudio
Tabla 2. Comparación de los parámetros oftalmológicos en los grupos de pacientes con DM2 (con/sin RD) y los controles sanos
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Resumen
Objetivo

Identificar genes implicados en los mecanismos patogénicos de la retinopatía diabética no proliferante, como estrés oxidativo, alteración de la matriz extracelular y/o apoptosis, para valorar el riesgo de desarrollo de la misma en una población de diabéticos tipo2 (DM2).

Material y métodos

Estudio de casos y controles en 81 participantes del Estudio Valencia sobre Retinopatía Diabética (EVRD), de ambos sexos y con edades comprendidas entre los 25 y 85años, clasificados en: 1)grupo DM2 (n=49), con RD (+RD; n=14) y sin RD (−RD; n=35), y 2)grupo control (GC; n=32). Se realizó entrevista personal, examen oftalmológico estandarizado y extracción de sangre que se procesó para analizar el ADN y determinar la expresión de: TP53, MMP9 y SLC23A2 en todos los participantes. El programa estadístico utilizado fue el SPSS v22.0.

Resultados

Los genes TP53 y MMP9 aumentaron su expresión en el grupo DM2 respecto al GC, aunque solo de manera significativa el gen MMP9 (TP53: 10,40±1,20 vs. 8,23±1,36, p=0,084; MMP9: 1,45±0,16 vs. 0,95±0,16, p=0,036) y el gen SLC23A2 disminuyó significativamente sus niveles en DM2 vs. GC (5,58±0,64 vs. 11,66±1,90, p=0,026). Al subdividir el grupo DM2 según presencia de retinopatía, la expresión de los genes TP53, MMP9 y SLC23A2 mostró diferencias significativas entre los grupos DM2−RD, DM2+RD y GC (TP53: 9,95±1,47 vs. 11,52±2,05 vs. 8,23±1,36, p=0,038; MMP9: 1,47±0,20 vs. 1,41±0,27 vs. 0,95±0,16, p=0,021; SLC23A2: 5,61±0,77 vs. 5,51±1,21 vs. 11,66±1,90, p=0,018).

Conclusiones

Los genes reguladores de apoptosis (TP53) e integridad de la matriz extracelular (MMP9) podrían estar implicados en la susceptibilidad para el desarrollo/progresión de la RD, así como el gen SLC232A2 (transportador del ácido ascórbico) puede comportarse como protector del riesgo de padecer/progresar en la retinopatía.

Palabras clave:
Retinopatía diabética
Genes
Diagnóstico molecular
Abstract
Objective

To identify genes involved in the pathogenic mechanisms of non-proliferative diabetic retinopathy (NPDR), among which include oxidative stress, extracellular matrix changes, and/or apoptosis, in order to evaluate the risk of developing this retinal disease in a type2 diabetic (DM2) population.

Material and methods

A case-control study was carried out on 81 participants from the Valencia Study on Diabetic Retinopathy (VSDR) of both genders, with ages 25-85years. They were classified into: (i)DM2 group (n=49), with DR (+DR; n=14) and without DR (−DR; n=35), and (ii)control group (GC; n=32). The protocols included a personal interview, standardised ophthalmological examination, and blood collection (to analyse the DNA for determining the gene expression (TP53, MMP9, and SLC23A2) in the study groups. Statistical analyses were performed using the SPSS v22.0 program.

Results

The TP53 and MMP9 genes showed a higher expression in the DM2 group compared to the GC, although the difference was only significant for the MMP9 gene (TP53: 10.40±1.20 vs. 8.23±1.36, P=.084; MMP9: 1.45±0.16 vs. 0.95±0.16, P=.036), and the SLC23A2 gene showed a significant lower expression in the DM2 vs CG (5.58±0.64 vs. 11.66±1.90, P=.026). When sub-dividing the DM2 group according to the presence of retinopathy, the expression of the TP53, MMP9 and SLC23A2 genes showed significant differences between the DM2−RD, DM2+RD and GC groups (TP53: 9.95±1.47 vs. 11.52±2.05 vs. 8.23±1.36, P=.038; MMP9: 1.47±0.20 vs. 1.41±0.27 vs. 0.95±0.16, P=.021; SLC23A2: 5.61±0.77 vs. 5.51±1.21 vs. 11.66±1.90, P=.018).

Conclusions

Genes involved in extracellular matrix integrity (MMP9) and/or apoptosis (TP53), could be considered potential markers of susceptibility to the development/progression of NPDR. Interestingly, the SLC232A2 gene (ascorbic acid transporter) can be considered a protector of the risk of the development/progression of the retinopathy.

Keywords:
Diabetic retinopathy
Genes
Molecular diagnosis
Texto completo
Introducción

Los casos de diabetes mellitus (DM) están constantemente aumentando en todo el mundo. Esta prevalencia se debe principalmente al tipo2 (DM2), que se relaciona con la obesidad y el sedentarismo, estableciéndose como un problema sociosanitario de gran magnitud, tanto en adultos1 como en la población infantil2. Por ello se necesitan programas de detección precoz y el desarrollo de biomarcadores validados que permitan trasladar a la clínica los estudios moleculares y genéticos, para prevenir la presentación de la DM y las complicaciones derivadas de la cronicidad del proceso, entre ellas la retinopatía diabética (RD)1-3.

Para desarrollar DM2 es preciso que coexistan factores endógenos y exógenos, entre ellos los potencialmente modificables, destacando, como ya hemos comentado, el sobrepeso y la ausencia de ejercicio físico, que provocan alteraciones en la secreción de insulina como respuesta al estímulo de la hiperglucemia, y cambios en la acción de la hormona en tejidos periféricos. Sin embargo, estudios epidemiológicos y experimentales han demostrado que, en el contexto de la hiperglucemia, la hipertensión arterial y la dislipemia son factores importantes, pero no suficientes para el desarrollo de las complicaciones crónicas de la DM24.

Aunque en la etiopatogenia de la DM2 se implican diversos mecanismos, tales como inflamación, angiogénesis, apoptosis, etc., el factor genético es fundamental para completar el conocimiento de las bases celulares y moleculares de esta enfermedad5-7. Pese a ello, aún no se conocen todos los genes implicados en el desarrollo de la misma o, más directamente, aquellos que se relacionen con la forma de presentación clínica y la respuesta farmacológica.

La RD es la principal causa de pérdida visual en todo el mundo en la franja etaria correspondiente a la actividad laboral. De los casi 300 millones de diabéticos, aproximadamente una tercera parte tienen signos de RD, y de ellos, al menos una tercera parte padecen graves complicaciones en el curso de la enfermedad, incluyendo el desprendimiento de retina, el glaucoma neovascular o el edema macular diabético8-10. Investigaciones recientes han descrito numerosas vías biológicas implicadas en la patogenia de la RD, entre las que destacan la inflamación, el estrés oxidativo/nitrosativo, la alteración de ciertas hormonas relacionadas con vías metabólicas (leptina y adiponectina), las vitaminasC yD, y la apoptosis8-16.

Se ha sugerido que la progresión de la RD estaría genéticamente determinada, principalmente el paso de la RD no proliferante a las formas proliferantes10,16,17. Pero, no todos los pacientes DM2 evolucionan hacia la RD, ni lo hacen de forma similar, como los diabéticos que presentan formas avanzadas de retinopatía con muy poco tiempo de evolución de la DM2. Además, la respuesta a los fármacos es también muy variable entre los individuos afectos. En algún caso los fármacos pueden retrasar o detener el curso de la retinopatía, aunque en ningún paciente se puede lograr la reversibilidad del proceso10,15,16. Aunque cada vez hay más evidencias de que las alteraciones genéticas contribuyen al desarrollo de la RD, la identificación de los genes implicados es muy difícil, existiendo para ello diversas técnicas, algunas de las cuales se citan brevemente a continuación18-20.

Es posible que la forma más directa para identificar un gen candidato a la susceptibilidad para la enfermedad sea la identificación de una alteración cromosómica (que trastoca uno o más genes: anormalidad citogenética). No obstante, hay que considerar que las alteraciones citogenéticas y el análisis de ligamiento son estrategias de identificación de genes responsables de enfermedades en los casos familiares y que los estudios de asociación son adecuados para los casos esporádicos. Otra posibilidad es el análisis de ligamiento y clonación posicional (localización del gen responsable según su posición cromosómica, estrechando un intervalo que contiene el gen enfermo en un cromosoma determinado). Por otra parte, el análisis de asociación se basa en que dos alelos ligados en el mismo cromosoma seguirán transmitiéndose juntos en cada meiosis, hasta que se separen por recombinación meiótica, y en ese momento se distribuirán en gametos distintos y se asociarán independientemente. Estudios de asociación intentan hallar correlaciones de marcadores genéticos de una enfermedad mediante el test para el desequilibrio de ligamiento en una población dada, adquiriendo mayor potencia para detectar alelos de riesgo de enfermedad leve/moderada, que el análisis de ligamiento. Variantes de esta técnica son los estudios de asociación de genes candidatos posicionales (en los que se aplican los test de genes de asociación directa, siguiendo al análisis de ligamiento para el que se identificó previamente una región cromosómica, identificando genes de esa región, y limitando el número de genes que deben ser cribados) y los estudios funcionales de asociación de genes candidatos (alternativa a la anterior, pero que no precisa conocer la localización cromosómica del gen).

Uno de los genes más estudiados en relación a la RD es el gen del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Este factor de crecimiento provoca la neovascularización típica de la RD proliferativa y la aparición y desarrollo del edema macular diabético. Debido a su clara relación con los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad, se han estudiado muchos polimorfismos del gen VEGF y cada día aparecen nuevos datos sobre variantes de este gen posiblemente asociadas a la RD. Aunque en muchos casos esta asociación es débil o inconsistente, en otros hay suficiente evidencia de la implicación de variantes del gen VEGF en el riesgo de RD21-23. Además de este gen, muchos otros han sido asociados a la retinopatía, apareciendo nuevos estudios cada día. Genes como SLC2A11, SLC24A3, DRD2, HTR1B, INSR, TNFα o IL10 se asocian a riesgo de RD24,25, mientras que otros, como eNOS3, parecen tener un efecto protector26.

Pese a todo, los investigadores que han trabajado para identificar genes de susceptibilidad genética o de progresión para la RD no han logrado aportar descubrimientos sobresalientes en los últimos 10años por los resultados contradictorios entre ellos, las distintas poblaciones estudiadas y la falta de reproducibilidad de los datos obtenidos27-35.

Además, aún hay muchos genes que potencialmente podrían estar involucrados en el desarrollo y/o progresión de la RD y que aún no han sido estudiados, como los genes SLC23A2, MMP9 y TP53.

El miembro número 2 de la familia 23 de transportadores de solutos (Solute Carrier family 23 member 2 [SLC23A2]) es una proteína codificada en humanos por el gen SLC23A236 cuya función es actuar como transportador del ácido ascórbico (vitaminaC). Se sabe que hay notables diferencias entre el consumo de vitaminaC y sus niveles en sangre periférica y tejidos. En ocasiones dependen de factores modificables, como el tabaquismo, la obesidad y la hiperglucemia. De hecho, se ha sugerido que hay una correlación negativa entre la ingesta diaria de vitaminaC y el riesgo de DM237.

Las proteasas de la matriz extracelular, como la familia de metaloproteinasas (MMP), están implicadas en la ruptura de la matriz en procesos normales y patológicos. Algunas MMP son secretadas como pro-proteínas inactivas, que se activan cuando se unen a proteinasas extracelulares. La enzima que codifica por el gen MMP9 degrada los colágenos tiposiv y v, así como otras proteínas de la matriz, en situaciones normales y patológicas38. Recientemente se han descrito los niveles alterados de MMP9 en pacientes con DM2, y la asociación entre el polimorfismo MMP9-1562C/T y las complicaciones diabéticas39.

La serie de proteínas tumorales p53, también conocidas como proteínas relacionadas con la transformación (Transforming Related Protein 53 [TRP53]), están codificadas en humanos por el gen supresor tumoral TP5340, que regula la estabilidad genómica (ciclo celular, senescencia, apoptosis) y previene mutaciones, por lo que se le denomina «guardián del genoma». En la actualidad se conocen al menos 12 proteínas codificadas por dicho gen. Recientemente ha sido implicado en DM41. A nivel ocular, un trabajo experimental de nuestro grupo ha demostrado su participación en la regulación del estrés endógeno en la retina y en el nervio óptico del ratón transgénico42.

Hemos llevado a cabo un estudio diseñado para identificar genes relacionados con el estrés oxidativo (transporte de vitaminas antioxidantes) como el SLC23A2, integridad de la matriz extracelular como el MMP9, y la regulación de la apoptosis como el TP53, en un grupo de pacientes con DM2, con y sin retinopatía, para hallar su expresión diferencial, comparándolos con un grupo de sujetos sanos y establecer su implicación en el inicio y la progresión de la RD.

Método

Estudio de casos y controles pareados por edad y género seleccionados de la base de datos del Estudio Valencia sobre Retinopatía Diabética (EVRD)15, el presente trabajo corresponde al informe n.° 3, según los criterios de inclusión/exclusión propuestos para este trabajo (tabla 1), con el propósito de identificar genes relacionados con los mecanismos patogénicos de la retinopatía en pacientes con DM2. El estudio fue aprobado por los comités de ética e investigación clínica de los centros correspondientes. Todos los experimentos se han ajustado a la normativa para la investigación humana (Helsinki Declaration on Human Experimentation; Helsinki 1964, versión actualizada 2004) y en concordancia con la normativa actual de la Comunidad Europea para estudios genéticos. Los participantes fueron informados y firmaron el consentimiento para participar en el estudio.

Tabla 1.

Criterios de inclusión/exclusión en el estudio

Inclusión
Grupo de pacientes DM2  Grupo de controles 
Edad 25 a 85 años  Edad 25 a 85 años 
Diagnóstico de DM2 de al menos 5 años. Pacientes con o sin retinopatía  No DM (tipos 1 o 2). No retinopatía 
Ninguna enfermedad sistémica crónica o degenerativa  Ninguna enfermedad sistémica crónica o degenerativa 
Exclusión
Grupo de pacientes DM2  Grupo de controles 
Edad <25 años o > 85 años  Edad <25 años o > 85 años 
Diagnóstico de DM2 < 4 años  Padecer DM (tipos 1 o 2) 
Padecer enfermedad sistémica crónica o degenerativa  Padecer enfermedad sistémica crónica o degenerativa 

DM: diabetes mellitus; DM2: diabetes mellitus tipo 2.

La muestra fue calculada mediante el programa eNe 2.0 (Glaxo Smith Kline S.A.), obteniendo un poder estadístico del 80% y detectando diferencias en los contrastes de la hipótesis de trabajo (Ho: p1=p2) y utilizando una prueba bilateral del χ2 para dos muestras independientes, considerando que el nivel de significación fuera del 5%. Así, la muestra de participantes está formada por 81 personas de ambos sexos y edades comprendidas entre los 25 y los 85años, que fueron clasificadas en: 1)grupo DM2 (n=49), con RD (+RD; n=14) y sin RD (−RD; n=35), y 2)grupo control de sujetos no diabéticos y sin retinopatía (GC; n=32).

Definición operativa

Se realizó entrevista personal, incluyendo datos sobre la DM2 (inicio, duración, tratamiento y antecedentes familiares), características personales (otras enfermedades, otros tratamientos, talla, peso) y estilo de vida (nutrición, ejercicio físico, hábito tabáquico/alcohólico, etc.).

Se llevó a cabo un examen oftalmológico estandarizado (agudeza visual mejor corregida (AVMC), presión intraocular (PIO), biomicroscopia de segmento anterior y medio, estudio del fondo de ojo mediante dilatación y examen mediante lente de 78D, retinografías (TOPCON ImageNet TRC-50JA, Barcelona, España) y medida del espesor central de la capa de fibras nerviosas de la retina mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) (Carl Zeiss Meditec, Madrid, España). La presencia o ausencia de RD se basó en los hallazgos fundoscópicos y las descripciones de la actualización sobre la normativa de la Sociedad Española de Retina y Vítreo43. La clasificación de la retinopatía se ajustó a la escala internacional de severidad de la RD, según el estudio para el tratamiento precoz de la RD (Early Treatment Diabetic Retinopathy Study [ETDRS])44 y la normativa actual de la Academia Americana de Oftalmología45.

Para obtener las muestras biológicas se programó la extracción de sangre en ayunas para el análisis de la expresión génica, que se realizó en los laboratorios de la Unidad de Investigación Oftalmológica «Santiago Grisolía»/FISABIO, Unidad de Oftalmobiología Celular y Molecular de la Universidad de Valencia, y en el Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública de la Universidad de Valencia, cuyo procedimiento se describe brevemente a continuación.

Extracción y cuantificación del ARN en sangre

Primero se separó el suero por sedimentación y se centrifugó 15min a 2.000rpm. Tras eliminar el sobrenadante, se lavó el pellet varias veces con PBS. Después de los lavados se añadió trizol (500-1.000μl, dependiendo del tamaño del pellet) y se almacenó a −80°C hasta el día siguiente. Posteriormente, tras descongelar las muestras, se homogenizaron para asegurar la rotura celular. Se añadió cloroformo y se centrifugaron las muestras (13.000rpm, 15min). La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo, se añadió isopropanol y se dejaron las muestras a −20°C toda la noche. Al día siguiente se centrifugaron (13.000rpm, 15min) y se eliminó el sobrenadante. Se añadió etanol 75% frío, se centrifugó de nuevo (13.000rpm, 15min, a 4°C). Por último, tras eliminar completamente el etanol, se resuspendió el pellet en 20μl de agua libre de RNasas, se cuantificó el ARN mediante espectrofotometría (NanoPhotometer, Implen GmbH, Schatzbogen 52, D-81829, Alemania) y se almacenaron las muestras a −80°C.

Conversión a ADN complementario (cDNA) y cuantificación

Para convertir el ARN a cDNA se utilizó el kit High Capacity RNA-to-cDNA (Ref. 4387406, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se retrotranscribieron 300ng de ARN de cada muestra de sangre procesada de cada uno de los participantes. Las condiciones de la PCR fueron: 5min/25°C, 30min/42°C y 5min/85°C. La cuantificación se realizó mediante espectrofotometría (NanoPhotometer, Implen GmbH, Schatzbogen 52, D- 81829, Alemania).

Análisis de la expresión de los genes estudiados

Se analizó la expresión relativa de los genes TP53, MMP9 y SLC23A2 mediante qPCR en tiempo real, utilizando sondas Taqman y el 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Las muestras se analizaron por duplicado y se usó el gen GAPDH (3-gliceraldehído fosfato deshidrogenasa) como gen de referencia (housekeeping). Las condiciones para la PCR fueron: 2min/50°C, 10min/95°C, y 40 ciclos 15segundos/95°C y 1min/60°C.

Análisis estadístico

El programa estadístico utilizado para el análisis de todos los datos fue el SPSS 22.0. (IBM SPSS Statistics for Windows 22.0 program, IBM Corp., Armonk, NY, EE.UU.). La normalidad de las variables cuantitativas fue determinada mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Las variables categóricas fueron comparadas utilizando la prueba de χ2 de Pearson. La comparación entre medias se realizó mediante el test U de Mann Whitney para variables no normales. La comparación de más de dos medias se realizó mediante el test de Kruskal-Wallis. El Rho de Spearman se utilizó para determinar la magnitud de la asociación de 2 variables cuantitativas.

La expresión relativa de cada gen se calculó utilizando la fórmula del doble ΔCt46.

Todos los análisis estadísticos fueron realizados asignando un valor de significación de 0,05.

Resultados

Los hallazgos de fondo de ojo respecto al diagnóstico de RD fueron: DM2+RD, n=14 (28,6%) y DM2−RD, n=35 (71,4%).

La tabla 2 muestra los distintos valores obtenidos de los participantes en el estudio durante el examen oftalmológico.

Tabla 2.

Comparación de los parámetros oftalmológicos en los grupos de pacientes con DM2 (con/sin RD) y los controles sanos

Parámetro    GC  GDM2−R  GDM2+RD 
AVMC (dec.)OD  0,97±0,01  0,84±0,05  0,66±0,08  0,000* 
OI  1,00±0,03  0,80±0,07  0,60±0,09  0,000* 
PIO (mmHg)OD  13,9±0,9  15,9±0,8  16,1±0,8  0,610 
OI  15,0±1,0  16,5±0,8  15,8±0,8  0,886 
EMC (SD-0CT; μm)OD  248,1±8,9  247,4±6,7  290,3±15,8  0,014* 
OI  248,6±7,9  262,5±15,0  299,3±28,1  0,280 

AVMC: agudeza visual mejor corregida; EMC: espesor macular central; GC: grupo control; GDM2+RD: grupo diabetes mellitus tipo 2 con retinopatía diabética; GDM2−RD: grupo diabetes mellitus tipo 2 sin retinopatía diabética; OD: ojo derecho; OI: ojo izquierdo; PIO: presión intraocular.

*

Diferencias estadísticamente significativas (p<0,05), obtenidas mediante análisis de Kruskal-Wallis.

Los valores son la media±error estándar.

En la figura 1A se observa que la expresión del gen SLC23A2 ha sido significativamente inferior en el DM2 vs. GC (5,58±0,64 vs. 11,66±1,90, p=0,026). Al subdividir el grupo de diabéticos según presencia de RD y realizar la comparación de la expresión del gen SLC23A2 entre los 3 grupos, observamos que se mantiene la significación respecto al grupo control (DM2−RD: 5,61±0,77, DM2+RD: 5,51±1,21, GC: 11,66±1,90; p=0,018) (fig. 1B).

Figura 1.

Expresión relativa del gen SLC23A2 en los participantes del estudio. A)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 (DM2) y el grupo control (CTRL). B)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 sin retinopatía diabética (DM2−RD) el grupo de diabéticos tipo2 con retinopatía diabética (DM2+RD) y el grupo control (CTRL). El asterisco denota diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control (p<0,05).

(0,09MB).

En cuanto al gen MMP9, la expresión ha sido significativamente superior en el DM2 vs. GC (1,45±0,16 vs. 0,95±0,16, p=0,036) (fig. 2A). Las diferencias de expresión del gen MMP9 al comparar los tres grupos también fueron estadísticamente significativas (DM2−RD: 1,47±0,20, DM2+RD: 1,41±0,27, GC: 0,95±0,16; p=0,021) (fig. 2B).

Figura 2.

Expresión relativa del gen MMP9 en los participantes del estudio. A)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 (DM2) y el grupo control (CTRL). B)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 sin retinopatía diabética (DM2−RD), el grupo de diabéticos tipo2 con retinopatía diabética (DM2+RD) y el grupo control (CTRL). El asterisco denota diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control (p<0,05).

(0,09MB).

Por último, la expresión del gen TP53 fue superior en el DM2 vs. GC, aunque no alcanzó la significación estadística (10,40±1,20 vs. 8,23±1,36, p=0,084) (fig. 3A). Sin embargo, la comparación entre los tres grupos mostró diferencias estadísticamente significativas (DM2−RD: 9,95±1,47, DM2+RD: 11,52±2,05, GC: 8,23±1,36; p=0,038) (fig. 3B).

Figura 3.

Expresión relativa del gen TP53 en los participantes del estudio. A)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 (DM2) y el grupo control (CTRL). B)Comparación entre el grupo de diabéticos tipo2 sin retinopatía diabética (DM2−RD), el grupo de diabéticos tipo2 con retinopatía diabética (DM2+RD) y el grupo control (CTRL). El asterisco denota diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control (p<0,05).

(0,09MB).

En ningún caso la expresión de los genes mostró diferencias significativas entre el grupo de diabéticos sin retinopatía y el grupo con retinopatía.

Discusión

La RD es causa principal de pérdida de visión en todo el mundo. La prevalencia de la RD en Europa varía entre el 22 y el 37%, lo que implica un importante coste sociosanitario. Es necesario investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la hiperglucemia, tanto para el riesgo de presentar RD como por los procesos implicados en su progresión y la susceptibilidad a las complicaciones. Por ello hemos analizado la expresión de genes relacionados con el estrés oxidativo (transporte de vitaminas antioxidantes), específicamente el SLC23A2, integridad de la matriz extracelular como el MMP9, y regulación de la apoptosis, en concreto el TP53, en un grupo de pacientes con DM2 seleccionados de la base de datos del EVRD, subdivididos en diabéticos con y sin RD, que han sido comparados con un grupo de sujetos control. Nuestros datos mostraron una expresión diferencial significativa de los tres genes entre los grupos DM2 y GC (p<0,05). Además, el gen SLC23A2 mostró variaciones significativas en sus niveles de expresión en cuanto a la presencia o no de retinopatía (p<0,05).

El mecanismo que activa la cascada de hechos celulares y moleculares que inician el desarrollo de la microangiopatía diabética es precisamente la alteración de la membrana basal capilar y la pérdida de pericitos3,10-17. Se sabe que incluso preclínicamente es posible detectar la disfunción vascular en los capilares retinianos, implicando diversos procesos del endotelio y músculo liso. Además, estos cambios precoces son consecuencia del aumento de las endotelinas y de la disminución del óxido nítrico en el contexto de estrés oxidativo/nitrosativo. Estos fenómenos iniciales continúan con el aumento de la permeabilidad capilar, en la que intervienen procesos como las anomalías de la matriz extracelular, la pérdida de pericitos y de células endoteliales inducida por la isquemia, y el agravamiento del estrés oxidativo. La disfunción vascular progresa y se presenta el engrosamiento de la membrana basal capilar y la aparición del resto de signos y síntomas que ponen de manifiesto el desarrollo de la RD. En todo este proceso, las vías de señalización y las moléculas implicadas son innumerables.

Se ha demostrado que la disminución de vitaminaC en un factor de riesgo para desarrollar la DM. La vitaminaC es un potente antioxidante y cofactor de múltiples reacciones enzimáticas, incluyendo la síntesis de colágeno en el tejido conectivo (piel, cartílago, dientes, huesos y vasos sanguíneos). Es imposible sintetizarla en nuestro organismo, dependiendo de su ingesta el obtener los niveles diarios recomendados por los expertos. Datos observacionales del estudio llevado a cabo en los Estados Unidos, The National Health and Nutrition Examination Survey (NHANESI [1971-1974]; II [1976-1980] y III [1998-1994]) identificaron a personas con diagnóstico reciente de DM y apreciaron que tenían niveles bajos de vitaminaC en suero47-49 Estos hallazgos han sido confirmados por otros estudios poblacionales en diabéticos50,51 que describen la correlación inversa entre los niveles de vitaminaC y la HbA1c. Las proteínas que transportan solutos (como las vitaminas) están codificadas por el gen SLC. El miembro número2 de la familia 23 de transportadores de solutos (Solute Carrier family 23 member 2 [SLC23A2]) es una proteína codificada en humanos por el gen SLC23A236 y su principal función es transportar la vitaminaC. Hemos observado que el gen SLC23A2 se infraexpresó en el grupo de diabéticos, como se puede apreciar en la figura 1A. Del mismo modo, la expresión del gen en los diabéticos con y sin retinopatía fue significativamente menor a la observada en el grupo control (ver fig. 1B). De ello se deduce que los niveles de vitaminaC están altamente regulados por el gen SLC23A2, del que dependen su biodisponibilidad y sus funciones en el organismo. Sin embargo, no hay estudios que relacionen la expresión de este gen y la RD. En relación con otros procesos oculares sí se ha descrito la asociación entre variaciones del gen SLC23A2 (en concreto el polimorfismo rs1279683), la concentración plasmática de vitaminaC y el riesgo de glaucoma52,53. Sugerimos que la baja expresión del gen SLC23A2 en los pacientes con RD de este estudio sugiere que el transporte de vitaminaC está muy alterado, impidiendo su llegada a los órganos diana, como la retina, donde no podrá ejercer su acción protectora antioxidante en el momento en el que este proceso esté favoreciendo el desarrollo y/o la progresión de la RD, ya que el aumento del estrés oxidativo induce la activación de factores de transcripción sensibles a redox, cambiando así la expresión de muchos genes.

La matriz extracelular está constituida por una serie de proteínas (colágeno, elastina, etc.), proteoglucanos y glucoproteínas que confieren las propiedades estructurales a las células y tejidos. Alteraciones de dicha matriz implican la pérdida de sus funciones, entre ellas la de nutrición, filtrado, eliminación, pérdida de la capacidad de regeneración y cicatrización y alteración de la transmisión mecánica, así como la pérdida del sustrato para la respuesta inmune. Las MMP de la matriz extracelular son las encargadas de degradar dicha matriz, y por ello están implicadas en diversos procesos normales y patológicos, como la RD54. De hecho, la proteína MMP9 está aumentada en neovascularización activa, y se ha demostrado que posee funciones pro-apoptóticas. Se ha descrito un mecanismo mediante el cual la DM activa MMP9 y su cadena de señalización, con la participación entre otros, de H-Ras55,56. De hecho, la hiperglucemia activa una proteínaG de bajo peso molecular, H-Ras, en la retina y sus capilares, cuyo principal efecto es provocar la apoptosis de las células de dichos vasos, pericitos y células endoteliales. La proteína MMP9 está regulada por H-Ras y en la diabetes su activación se asocia con aumento de la permeabilidad vascular57. La hiperglucemia activa dicha proteína MMP-9, y esta acelera la apoptosis de las células de los capilares retinianos, fenómeno que inicia el desarrollo de la RD; nuestros resultados concuerdan con estas descripciones, sosteniendo que el gen que codifica para la proteína MMP9 está sobreexpresado en los pacientes con DM2 frente a los sujetos del GC, aunque no hemos conseguido demostrar que su expresión cambiase respecto a padecer o no RD. Sin embargo, otros autores han descrito la asociación entre el polimorfismo MMP9-1562C/T y las complicaciones de la DM239.

Como se ha reflejado anteriormente, la apoptosis de las células de la microcirculación retiniana inicia el desarrollo de la RD. El gen TP53 regula el ciclo celular la senescencia y la apoptosis58. No se han encontrado polimorfismos en este gen asociado a la RD. En cambio, sí hay evidencia de la asociación del polimorfismo Arg72Pro tanto con la DM1 como con la DM259,60. En nuestro estudio hemos apreciado el aumento significativo de la expresión de TP53 en pacientes con DM2 frente al GC, tal como ha sido sugerido por otros autores61. Además, es posible que otras moléculas, tales como citoquinas, factores de crecimiento, hormonas y productos metabólicos del estrés oxidativo, puedan sobrerregular la expresión de los genes pro-apoptóticos en la microvasculatura, colaborando con el estrés oxidativo y la isquemia para activar la apoptosis y la RD, como hemos sugerido con anterioridad para la astroglia retiniana62.

En conclusión, hemos identificado genes implicados en el transporte de vitaminas antioxidantes, homeostasis de la matriz extracelular y regulación de la apoptosis. Este estudio sugiere que la desregulación de los genes SLC23A2, MMP9 y TP53 promovida por la hiperglucemia crónica está relacionada con la susceptibilidad para el inicio de la RD y la progresión de la misma hacia la forma proliferante.

Lista completa investigadores EVRD

V. Zanón-Moreno, S. M. Sanz-González, J. J. García-Medina, A. LLeó-Perez, M. J. Roig-Revert, J. Marín-Montiel, V. Chaqués Alepuz, L. Alonso Muñoz, K. Shoaie Nia, L. Duarte, C. Campos Borges, O. Alvarez-Barrachina, J. Raga-Cervera, V. Chiner, M. Perez-Ramos, G. Roglá Navarro, M. Albert-Fort, M. F. García-Esparza, M. Saleh Rahhal, V. Vila-Bou, M. Villalonga, M. L. Redón, A. Llorca-Cardeñosa, R. Gallego-Pinazo, R. Dolz-Marco, M.I. López-Gálvez, D. Galarreta-Mira, L. Manzanas, E. Bendala-Tufanisco, F. Santander-Trentini, M. Salgado-Borges, A.L. López-Ramos, G. Virgili, C. Nucci, J. F. Arévalo, y Maria D. Pinazo-Durán.

Financiación

El trabajo ha sido financiado en parte con con los proyectos FIS/FEDER PI13/00480 y PI16/00797 (IP: Dra. Pinazo-Durán) y con el proyecto de Thea Laboratories 2013-2016 (Barcelona, Clermond Ferrand; IP: Dra. Pinazo-Durán).

Conflicto de intereses

Los autores afirman no tener conflicto de intereses en el presente trabajo.

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Los autores comparten el primer lugar en este trabajo.

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